凌 濤，謝 佳，孫大勇※，錢(qián)克儉

(1.深圳市龍崗中心醫(yī)院急診科，廣東 深圳 518116； 2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，南昌 330006)

膿毒癥指感染所致宿主反應(yīng)失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1-2]。炎癥和免疫反應(yīng)失衡導(dǎo)致微生物生長(zhǎng)失控，進(jìn)而發(fā)生致命性炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)組織損傷和器官功能障礙。肺是膿毒癥最常累及的靶器官，常導(dǎo)致急性肺損傷等肺功能障礙[3]。因此，避免或減輕膿毒癥所致急性肺損傷是降低膿毒癥死亡率的關(guān)鍵?？辜?xì)胞因子治療膿毒癥的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中取得了較好的研究結(jié)果，但對(duì)臨床膿毒癥患者生存率的影響并不大。最近，重組人活化蛋白C已經(jīng)從市場(chǎng)撤出，此外，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)拮抗劑的療效研究也未能達(dá)到第三階段試驗(yàn)的主要終點(diǎn)?？梢?jiàn)，阻斷單一炎癥介質(zhì)不足以阻斷炎性級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)。目前，膿毒癥治療在抗菌治療和器官支持治療方面取得了較大進(jìn)展，但患者預(yù)后仍不佳。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年膿毒癥患病人數(shù)超過(guò)1 900萬(wàn)，其中有600萬(wàn)患者死亡，病死率超過(guò)25%，已成為良性疾病的主要死因之一[4-5]。因此，迫切需要尋找有效的炎癥反應(yīng)上游靶點(diǎn)，以抑制炎癥的“瀑布反應(yīng)”。

組蛋白乙酰化修飾是生理和病理?xiàng)l件下基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一，對(duì)炎癥反應(yīng)和宿主防御反應(yīng)的影響較大。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDACs)共同催化調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，并通過(guò)靶向非組蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子影響基因表達(dá)。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是干擾HDACs功能的一類化合物，通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)組蛋白的乙?；潭日{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在惡性腫瘤和慢性炎癥性疾病等的治療中發(fā)揮治療作用。在膿毒癥及其相關(guān)肺損傷中，HDACIs可發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)和組織器官保護(hù)等多重作用。現(xiàn)就HDACIs在膿毒癥及急性肺損傷中的作用研究進(jìn)展予以綜述。

1 組蛋白乙酰化的概述

染色質(zhì)的基本單位是核小體，由四組核心組蛋白H2A、H2B、H3和H4構(gòu)成的八聚體及其周?chē)?47個(gè)DNA堿基對(duì)組成。核心組蛋白的氨基端尾在核小體突起，并且受到甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等調(diào)節(jié)和修飾。HATs和HDACs分別對(duì)組蛋白的N端氨基酸殘基進(jìn)行乙?；腿ヒ阴；{(diào)節(jié)。HATs將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白尾部，并可中和組蛋白的正電荷，弱化組蛋白與帶負(fù)電荷DNA的結(jié)合，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)疏松，有利于基因轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。而HDACs可使組蛋白去乙?；?，促使組蛋白與DNA緊密結(jié)合，導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。由此可見(jiàn)，核心組蛋白的乙酰化修飾是非常重要的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。組蛋白乙?；腿ヒ阴；钠胶馐д{(diào)使基因表達(dá)調(diào)控紊亂，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，因此，HDACs成為抗腫瘤藥物研究的熱門(mén)靶點(diǎn)之一。

HDACIs可引起乙?；诵◇w組蛋白堆積，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化和(或)凋亡。大量臨床試驗(yàn)證實(shí)，HDACIs具有良好的抗腫瘤作用，且毒副反應(yīng)輕微。通常將HDACIs分為NAD+依賴性酶和Zn2+依賴性酶兩大類，Zn2+依賴性酶包括HDACsⅠ、Ⅱ、Ⅳ亞族；NAD+依賴性酶主要是HDACsⅢ亞族。大多數(shù)HDACIs為廣譜抑制劑，但是每種HDACI對(duì)不同HDAC的抑制活性不同。目前，對(duì)Zn2+依賴HDACIs的研究較多，其中曲古抑菌素A(trichostatin A，TSA)是首個(gè)被確認(rèn)的天然來(lái)源的特異性HDACI[6]。美國(guó)食品藥品管理局已批準(zhǔn)辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)用于治療臨床晚期和難治性皮膚T細(xì)胞淋巴瘤[7]。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子、細(xì)胞因子受體等均受到乙?；{(diào)節(jié)，可見(jiàn)HDACIs可影響炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。HDACIs作用機(jī)制的相關(guān)研究為膿毒癥的治療提供了新的路徑。

2 HDACIs在膿毒癥中的應(yīng)用

近年來(lái)，對(duì)HDACIs在腫瘤治療中作用的研究較多。Leoni等[9]首次對(duì)膿毒癥中HDACIs作用的研究發(fā)現(xiàn)，SAHA可顯著降低脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)小鼠外周血單核細(xì)胞釋放的腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-12、α干擾素的水平，并可降低血液中細(xì)胞因子的水平。隨后，對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯堪l(fā)現(xiàn)，HDACIs可改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、移植物抗宿主病、哮喘、結(jié)腸炎和重癥胰腺炎等炎癥性疾病的結(jié)局[10-11]。Li等[12]對(duì)腹腔注射LPS誘導(dǎo)膿毒癥休克小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，SAHA干預(yù)1周后，小鼠存活率較對(duì)照組(非干預(yù)組)顯著提高。Zhao等[13]對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation perforation，CLP)誘導(dǎo)的致命性感染性休克模型小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，SAHA預(yù)處理可明顯提高小鼠的存活率，減少“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，并減輕遠(yuǎn)處器官損傷。TSA能顯著降低小鼠骨髓巨噬細(xì)胞中促炎因子的信使RNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平[14]。在LPS刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞后，可上調(diào)TLR4及HDAC2的蛋白表達(dá)，而TSA干預(yù)可下調(diào)LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞后的TLR4表達(dá)[15]。

HDACIs不僅能抑制膿毒癥中過(guò)度的炎癥反應(yīng)，還能發(fā)揮組織器官保護(hù)作用。Zhang等[16]對(duì)CLP誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)HDACIs預(yù)處理對(duì)照組小鼠相比，TSA組和丁酸鈉組小鼠肺組織的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞間黏附分子-1和E-選擇素的表達(dá)顯著降低，血漿IL-6水平降低，膿毒癥所致肺損傷明顯減輕，CLP小鼠的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。在CLP誘導(dǎo)膿毒癥小鼠中，TSA能降低肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平，對(duì)膿毒癥急性肺損傷具有保護(hù)作用[17]。Cetinkaya等[18]對(duì)新生高氧肺損傷模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉治療可改善肺損傷，減少促炎細(xì)胞因子及脂質(zhì)過(guò)氧化生物標(biāo)志物的表達(dá)，增強(qiáng)抗氧化酶活性。使用SAHA立即處理LPS誘導(dǎo)膿毒癥小鼠發(fā)現(xiàn)，SAHA可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的抗氧化酶谷胱甘肽的減少，減輕LPS誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，并有效改善膿毒癥繼發(fā)的急性肝損傷[19]。由此可見(jiàn)，HDACIs可抑制過(guò)度炎癥反應(yīng)，提高組織細(xì)胞存活能力，在膿毒癥治療中可能發(fā)揮重要作用。

3 HDACIs在膿毒癥治療中的作用機(jī)制

目前認(rèn)為，HDACIs本質(zhì)上是固有免疫細(xì)胞關(guān)鍵免疫受體表達(dá)和抗菌作用的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可降低巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬和殺傷作用，提高機(jī)體對(duì)非嚴(yán)重感染的易感性。當(dāng)機(jī)體發(fā)生膿毒癥和膿毒癥休克等嚴(yán)重感染時(shí)，HDACIs可保護(hù)組織細(xì)胞免受致命性的炎癥損傷。HDACIs對(duì)膿毒癥及相關(guān)肺損傷的保護(hù)作用可能通過(guò)以下途徑實(shí)現(xiàn)。

3.1抑制TLR4-髓樣細(xì)胞分化因子88 (myeloid differentiation factor 88，MyD88)-核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)/促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路 TLR4是一種跨膜蛋白，具有識(shí)別病原微生物、激活天然免疫系統(tǒng)、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等重要生物學(xué)功能。TLR4的結(jié)構(gòu)包括胞外域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)域，TLR4胞外域識(shí)別LPS后，其構(gòu)象發(fā)生變化，將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)域，TLR4胞內(nèi)域與MyD88 C端結(jié)合，同時(shí)MyD88的N端與IL-1受體相關(guān)激酶的N端結(jié)合，激活I(lǐng)L-1受體相關(guān)激酶，通過(guò)TNF受體相關(guān)因子6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子激活激酶1，進(jìn)而級(jí)聯(lián)激活下游的NF-κB和MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

NF-κB廣泛存在于細(xì)胞的蛋白質(zhì)復(fù)合物中，具有多向性DNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)細(xì)胞因子產(chǎn)生。在靜息狀態(tài)下，NF-κB的兩個(gè)亞單位p65、p50在細(xì)胞質(zhì)以失活狀態(tài)存在，當(dāng)上游信號(hào)(通常為MyD88介導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路)激活后，使p65、p50活化，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，以p65亞單位為著，并與相應(yīng)炎癥基因結(jié)合。與炎癥反應(yīng)關(guān)系較密切的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎癥介質(zhì)的基因啟動(dòng)子上均有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)，NF-κB與其結(jié)合后，可增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促使炎癥介質(zhì)大量釋放，從而導(dǎo)致組織細(xì)胞的炎性損傷。與非轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建的胰腺炎模型小鼠相比，雨蛙素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)NF-κB表達(dá)急性胰腺炎小鼠模型的NF-κB激活水平升高，且IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)明顯上調(diào)，胰腺炎加重[20]。將高選擇性HDAC6抑制劑Tubastatin應(yīng)用于LPS刺激的原代乳腺上皮細(xì)胞后，TNF-α和IL-1β等促炎細(xì)胞因子的釋放顯著降低，可能與HDAC6抑制導(dǎo)致NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制有關(guān)[21]。在NF-κB轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控中，p65的乙?；鸬疥P(guān)鍵作用，p65的乙酰化可降低p65與DNA的結(jié)合，并促進(jìn)其移出細(xì)胞核，從而抑制NF-κB活性[22]。

MAPK是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可將信號(hào)從細(xì)胞外轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部，并可介導(dǎo)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂、炎癥反應(yīng)及其對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)等多種細(xì)胞生理過(guò)程。MAPKs家族包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、c-Jun氨基端激酶、p38激酶等亞族，LPS可激活以上多條通路，使效應(yīng)細(xì)胞分泌炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn)，p38 MAPK抑制劑可降低急性胰腺炎動(dòng)物模型肺組織的中性粒細(xì)胞趨化因子和髓過(guò)氧化物酶的水平，減輕肺組織病理?yè)p傷[23]。Kim等[24]發(fā)現(xiàn)，HDACIs可提高CLP誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的存活率，減輕器官損傷，并降低血清TNF-α和IL-6水平，降低TLR4、磷酸化蛋白激酶p38、磷酸化c-Jun氨基端激酶和磷酸化胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶蛋白的表達(dá)。MAPK磷酸酶-1是受乙?；{(diào)節(jié)的MAPK通路負(fù)性調(diào)節(jié)因子，HDACIs可增強(qiáng)其對(duì)MAPK信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，使MAPK失活，抑制下游炎癥相關(guān)因子的表達(dá)。可見(jiàn)，NF-κB和MAPK活性均受到乙酰化的調(diào)節(jié)，HDACIs可通過(guò)抑制TLR4-MyD88-NF-κB/MAPK信號(hào)通道發(fā)揮抗炎作用。

3.2調(diào)控微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸，與靶基因信使RNA結(jié)合可促進(jìn)其降解或阻止靶基因翻譯，從而抑制靶基因表達(dá)[25]。部分miRNA在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[26]。目前研究較多的與促炎或抑炎作用相關(guān)的miRNA主要有miR-155、miR-146a、miR-132、miR-142、miR-302b等。與健康人群相比，膿毒癥患者miR-155 水平顯著升高，且miR-155水平與膿毒癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，高水平miR-155可誘導(dǎo)CD39+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的增殖，加重免疫抑制，加劇膿毒癥免疫失衡[27]。Taganov等[28]發(fā)現(xiàn)，LPS刺激可誘導(dǎo)人單核細(xì)胞miR-146a的分泌增加，從而抑制炎癥反應(yīng)，其作用可能是miR-146a抑制IL-1受體相關(guān)激酶1和TNF受體相關(guān)因子6，進(jìn)而抑制了NF-κB活性。對(duì)人體炎癥反應(yīng)過(guò)程中miRNA變化的研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，可用于感染與非感染全身炎癥反應(yīng)的鑒別[29]。研究證實(shí)，miR-146a參與了LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)[30]。Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，miR-132的表達(dá)上調(diào)，可見(jiàn)miR-132可能通過(guò)增強(qiáng)膽堿能抗炎途徑抑制LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥。將miR-142激動(dòng)劑預(yù)注射至CLP誘導(dǎo)膿毒癥小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)減弱，IL-2和TNF-α分泌減少，且外周血CD4+T/CD8+T細(xì)胞比例顯著提高；但若經(jīng)CLP處理后立即給予miR-142激動(dòng)劑，則上述作用消失，推測(cè)miR-142可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境抑制CLP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[32]。

HDACIs與miRNA關(guān)系密切。Scott等[33]采用微陣列分析法觀察HDACIs刺激乳腺癌細(xì)胞miRNAs表達(dá)變化的研究發(fā)現(xiàn)，HDACIs刺激后5個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)，22個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)，提示HDACIs可影響miRNA的表達(dá)。Jiang等[34]研究顯示，TSA可通過(guò)提高衰老小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NF-κB與miR-146a啟動(dòng)子的結(jié)合使miR-146a的表達(dá)顯著提高，進(jìn)而減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。Wang等[35]對(duì)骨關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，HDACIs可顯著提高miR-146a的表達(dá)，從而負(fù)向調(diào)節(jié)IL-1。因此，HDACIs可能通過(guò)miRNAs發(fā)揮其抗炎作用。

3.3抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡 肺泡上皮細(xì)胞凋亡是膿毒癥肺損傷過(guò)程中肺泡細(xì)胞死亡的主要機(jī)制之一。細(xì)胞色素C是由線粒體釋放的促凋亡蛋白，正常情況下存在于線粒體和細(xì)胞核內(nèi)部，LPS刺激后，細(xì)胞色素C從線粒體內(nèi)釋放至胞質(zhì)，激活胱天蛋白酶3，導(dǎo)致DNA上核酸酶切位點(diǎn)暴露，從而加速了氧自由基和核酸內(nèi)切酶的破壞，最終導(dǎo)致DNA片段化，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。陳隆望等[17]研究發(fā)現(xiàn)，TSA可抑制膿毒癥肺組織中凋亡相關(guān)蛋白細(xì)胞色素C、胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶9的表達(dá)，表明TSA可通過(guò)線粒體途徑減輕膿毒癥肺組織凋亡。Takebe等[36]研究也發(fā)現(xiàn)，CLP誘導(dǎo)敗血癥小鼠肺組織中HDAC1、HDAC2、HDAC3蛋白的水平降低，組蛋白H3、H4的乙?；皆龈?，廣譜HDACIs干預(yù)可顯著抑制肺和脾臟的細(xì)胞凋亡。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路在細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用。對(duì)大鼠失血性休克模型的研究發(fā)現(xiàn)，HDACI可提高腎細(xì)胞蛋白激酶B的磷酸化水平，下調(diào)凋亡蛋白Bad蛋白的表達(dá)，表明HDACI可通過(guò)蛋白激酶B途徑保護(hù)失血性休克大鼠腎細(xì)胞[37]。張力蛋白同源基因蛋白是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路的主要抑制性調(diào)節(jié)因子，HDACIs使張力蛋白同源基因蛋白過(guò)乙?；瑴p弱其抑制作用，使蛋白激酶B活性增加，從而抑制細(xì)胞凋亡。

4 小 結(jié)

膿毒癥致病因素復(fù)雜、感染部位不易明確、致病病原體類型繁多，導(dǎo)致治療難度大，對(duì)人類健康構(gòu)成巨大威脅。炎癥和免疫反應(yīng)失衡是膿毒癥發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制，目前尚缺乏針對(duì)膿毒癥發(fā)病機(jī)制的特異性藥物，膿毒癥治療仍以抗感染為主。但是目前的研究結(jié)果表明，HDACIs可在基因轉(zhuǎn)錄水平對(duì)膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的炎癥因子、炎癥信號(hào)通道等進(jìn)行調(diào)控，有望成為治療膿毒癥的新藥物，其作用機(jī)制可能包括：①抑制TLR4-MyD88-NF-κB/MAPK信號(hào)通道，減少炎癥因子的釋放；②調(diào)控miRNAs轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生；③抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡等。目前HDACIs在膿毒癥治療方面的研究尚處于起步階段，相關(guān)研究多為細(xì)胞或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，有效劑量能否安全用于人類尚不清楚。此外，目前應(yīng)用的HDACIs多為廣譜抑制劑，其作用機(jī)制較復(fù)雜，所致不良反應(yīng)的程度尚不明確，故仍需進(jìn)一步的研究。