張素仙 聶小鳳 張琴 冷天艷 楊麗華

昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科（昆明650101）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二，但其病死率卻位居婦科腫瘤之首［1］。卵巢癌對女性的健康和生命帶來了嚴重的威脅，但卵巢癌的發(fā)病機制目前仍不清楚，因此探索卵巢癌的發(fā)病機制具有重要的臨床及科研意義。LncRNA 是一類長度＞200 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［2］。近年發(fā)現(xiàn)，近18%的人類lncRNA 與腫瘤相關(guān)［3-5］。LncRNA 癌易感性候選基因2（Cancer susceptibility candidate 2，CASC2）是BALDINU 團隊2004年在子宮內(nèi)膜癌中首次發(fā)現(xiàn)［6］，其發(fā)現(xiàn)CASC2 通過可變性剪切形成3個轉(zhuǎn)錄變異體，分別為CASC2a、CASC2b 和CASC2c［7］。目前有研究［8］報道，lncRNA CASC2 在宮頸癌、非小細胞肺癌、胃癌、大腸癌、肝癌、胰腺癌、腎細胞癌、膀胱癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等許多人類腫瘤中起了重要作用。在卵巢癌中作用如何未見報道，本研究擬探討CASC2 在卵巢癌組織中的表達及對卵巢癌細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本 收集2015年9月至2017年9月昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科18 例上皮性卵巢癌（13 例高級漿液，2 例低級漿液性，1 例粘液樣，1 例子宮內(nèi)膜樣和1 例透明細胞癌）患者腫瘤組織和對應(yīng)的正常組織，組織立即在液氮中冷凍并在-80 ℃保存。沒有一個患者接受過化療或放療。這項研究得到了當?shù)貍惱砦瘑T會的批準，所有患者都獲得了知情同意。

1.2 上皮性卵巢癌細胞和正常卵巢上皮細胞5 株人卵巢癌細胞株A2780，Caov3，HO8910，SKOV3和OVCAR3 和人正常卵巢上皮細胞HOEpiC 購自中國科學(xué)院細胞庫。細胞用含雙抗和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液于37 ℃培養(yǎng)箱中，5%CO2濃度下培養(yǎng)。

1.3 實驗試劑 pc DNA3.1 質(zhì)粒、pcDNA-CASC2真核表達載體、脂質(zhì)體2000 、Trizol 試劑盒、qRTPCR 試劑盒購自賽默飛世爾科技公司。Annexin V/PI 凋亡檢測試購自劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，兔抗Bax、BCL-2 單克隆抗體、GAPDH 多克隆抗體購自博奧森，辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠及鼠抗兔二抗購自艾杰生物科技有限公司。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 人卵巢癌細胞SKOV3 用含100 mL/L 胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，置于37 ℃、50 mL/L CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于6 孔板，適量細胞接種在25 mm2培養(yǎng)皿中，24 h 后按照操作手冊應(yīng)用脂質(zhì)體2000將pcDNA-CASC2 重組質(zhì)粒、pc DNA3.1 空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入SKOV3 細胞。轉(zhuǎn)染后細胞分別命名為pcDNACASC2、pcDNA 細胞。

1.5 RNA 分離和定量實時PCR（qRT-PCR）檢測 根據(jù)試劑盒說明用Trizol 試劑從組織和細胞中提取出總RNA，使用qRT-PCR 試劑盒通過RNA和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，應(yīng)用qRT-PCR 檢測CASC2表達，以GAPDH 為對照。CASC2 引物正向鏈5′-TACAGGACAGTCAGTGGTGGTA-3′，反 向 鏈5′-ACATCTAGCTTAGGAATGTGGC-3′；PCR 結(jié)果是用2-ΔΔct 方法計算。

1.6 細胞增殖 MTT（四甲基偶氮唑鹽）檢測細胞活力 取轉(zhuǎn)染后SKOV3 細胞，調(diào)整細胞密度為5 ×103/mL，分別接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。轉(zhuǎn)染48 h 后MTT 法檢測細胞增殖情況，實驗獨立重復(fù)3 次。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細胞，用預(yù)冷的PBS 洗滌細胞2 次，分別加入5 μL Annexin V/FITC 和10 μL 20 μg/mL 的PI 溶液染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%，實驗獨立重復(fù)3 次。

1.8 Western blot 檢測Bcl-2、Bax 蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細胞，裂解后提取總蛋白。4 ℃下14 000 rpm 離心，收集上清液，進行SDSPAGE 電泳。電泳后轉(zhuǎn)至PVDF 膜后封閉60 min。加入稀釋的（1∶1 000）抗Bcl-2、Bax 蛋白的抗體，4 ℃過夜，PBS 洗膜5 min×3 次。再加入稀釋的（1∶2 000）辣根過氧化物酶標記的二抗室溫培育60 min，PBS 洗膜5 min×3 次。發(fā)光劑加于PVDF 膜上，暗室曝光顯示條帶。用Image 對條帶灰度進行檢測，并計算相應(yīng)灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)采用（）表示，各組間比較采用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA CASC2 在卵巢癌組織中的表達PCR 方法檢測18 例卵巢癌組織和癌旁正常組織LnCRNA CASC2 水平，卵巢癌組織組CASC2 水平顯著降低，見圖1（P＜0.01）。

圖1 上皮性卵巢癌組織LnCRNA CASC2 表達水平Fig.1 The expression of LnCRNA CASC2 in epithelial ovarian cancer

2.2 LncRNA CASC2 在上皮性卵巢癌細胞株中的表達 與人卵巢上皮細胞株HOEpiC 相比，上皮性卵巢癌細胞株A2780，Caov3，HO-8910，SKOV3和OVCAR3 中CASC2 mRNA 表達顯著降低，見圖2（P＜0.05）。

圖2 上皮性卵巢癌細胞株LnCRNA CASC2 表達水平Fig.2 The expression of LnCRNA CASC2 in epithelial ovarian cancer cell lines

2.3 pcDNA-CASC2 上調(diào)SKOV3 細胞CASC2 mRNA 表達 pcDNA-CASC2 載體轉(zhuǎn)染SKOV3 細胞后48 h，抽提細胞總RNA，qRT-PCR 檢測細胞CASC2 mRNA 表 達 水 平，發(fā) 現(xiàn)pcDNA-CASC2 組CASC2 mRNA 表達明顯上調(diào)，見圖3（P＜0.05）。

圖3 pcDNA-CASC2 上調(diào)SKOV3 細胞CASC2 mRNA 表達Fig.3 The expression of CASC2 mRNA upregulaed by pcDNA-CASC2 in SKOV3 cells

2.4 LncRNA CASC2 對SKOV3 細胞增殖的影響MTT 法檢測LnCRNA CASC2 對SKOV3 細胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)pcDNA-CASC2 上調(diào)SKOV3 細胞CASC2 mRNA 表達后細胞增殖能力降低，見圖4（P＜0.05）。

圖4 LnCRNA CASC2 對SKOV3 細胞增殖的影響Fig.4 The effect on SKOV3 cell proliferation by LnCRNA CASC2

2.5 LncRNA CASC2 對SKOV3 細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測CASC2 對SKOV3 細胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)pcDNA-CASC2 上調(diào)SKOV3 細胞CASC2 mRNA 表達后，細胞凋亡率顯著增加，見圖5（P＜0.05）。

2.6 LncRNA CASC2 對SKOV3 細胞侵襲能力的影響 Matrigel-Transwell 小室實驗檢測LnCRNA CASC2 對SKOV3 細胞侵襲能力的影響，發(fā)現(xiàn)pcDNA-CASC2 上 調(diào)SKOV3 細 胞CASC2 mRNA 表 達后，穿過小室的細胞數(shù)目減少，侵襲能力細胞降低，見圖6（P＜0.05）。

2.7 LncRNA CASC2 對SKOV3 細胞Bcl-2、Bax蛋白表達的影響Western blot 檢測結(jié)果顯示pcDNA-CASC2 上 調(diào)SKOV3 細 胞CASC2 mRNA 表達后，Bcl-2 表達降低、Bax 表達增高，見圖7（P＜0.05）。

3 討論

自2004年BALDINU 團隊在子宮內(nèi)膜癌中首次發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC2 后，在越來越多的腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了lncRNA CASC2 的作用，其在各種腫瘤中均發(fā)揮抑癌基因的作用，但在不同腫瘤中其機理不盡相同。如FENG 等［8］發(fā)現(xiàn)CASC2 在宮頸癌組織中表達降低，其低表達與患者較短的生存時間、較差的臨床病理特征相關(guān)，并認為其通過與miR-21的結(jié)合能夠上調(diào)PTEN 表達，增強宮頸癌對順鉑的敏感性。HUANG 等［9］報道CASC2 在大腸癌的組織和細胞中表達下調(diào)，并通過競爭miR-18a 調(diào)節(jié)PIAS3 mRNA 的表達，從而發(fā)揮抑制腫瘤進展的作用。GAN 等［10］報道CASC2 在肝癌組織和細胞系中表達下調(diào)，過表達CASC2 可以降低肝癌細胞增殖、遷移和侵襲，并通過失活MAPK 信號通路促進細胞凋亡。ZHOU 等［11］報道CASC2 通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）通路從而抑制胃癌細胞增殖、侵襲和血管生成。

圖5 LnCRNA CASC2 對SKOV3 細胞凋亡的影響Fig.5 The effect on SKOV3 cell apoptosis by LnCRNA CASC2

圖6 LnCRNA CASC2 對SKOV3 細胞侵襲能力的影響Fig.6 The effects on SKOV3 cell invasiveness b y LnCRNA CASC2

圖7 LnCRNA CASC2 對SKOV3 細胞Bcl-2、Bax 蛋白表達的影響Fig.7 The effect on bcl-2 and Bax protein expression in SKOV3 cells by LnCRNA CASC2

在本實驗中，通過RT-qPCR 檢測發(fā)現(xiàn)CASC2a在卵巢癌組織及卵巢癌細胞中低表達，一定程度上說明CASC2 與卵巢癌病理過程的相關(guān)性。在此結(jié)果的基礎(chǔ)上，筆者繼而研究了CASC2 對卵巢癌細胞生物學(xué)特性的影響，利用增殖實驗、遷移實驗發(fā)現(xiàn)CASC2 表達水平的升高可以抑制卵巢癌細胞SKOV3 的增殖和遷移。細胞學(xué)實驗進一步證明了CASC2 與卵巢癌的相關(guān)性，說明CASC2 在卵巢癌的病理過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。該結(jié)果與CASC2 在宮頸癌、大腸癌、肝癌等中發(fā)揮抑癌基因的作用相似，CASC2 在卵巢癌組織和細胞中的表達及對卵巢癌細胞生物學(xué)特性的影響為首次報道，提示CASC2 在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要的抑癌基因作用，但其具體作用機制仍需進一步研究。

筆者同時應(yīng)用Western blot 檢測卵巢癌細胞CASC2 水平變化后Bax、Bcl-2 水平，發(fā)現(xiàn)CASC2 水平增加后Bcl-2 表達降低，Bax 表達增高。Bcl-2、Bax 屬于Bcl-2 基因家族成員，被認為是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關(guān)鍵因子。Bax 具有誘導(dǎo)線粒體滲透性改變釋放細胞色素C、激活促凋亡蛋白Caspase-9，而表現(xiàn)出促細胞凋亡作用。Bcl-2 能夠增強線粒體膜電位，抑制鈣離子的釋放，從而發(fā)揮抗凋亡作用。有較多的研究提示Bcl-2 蛋白的功能不僅局限于調(diào)控細胞死亡，其在調(diào)節(jié)細胞遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移中也發(fā)揮著重要作用［12］。本研究中CASC2水平增加后Bcl-2 表達降低，Bax 表達增高，與流式細胞儀檢測的過表達CASC2 后卵巢癌細胞凋亡降低、侵襲實驗檢測的侵襲能力減弱結(jié)果一致，進一步說明CASC2 在卵巢癌中可發(fā)揮抑癌基因的作用，可能可作為卵巢癌預(yù)后或治療的靶點，值得進一步研究。