陳瑩 薛明新 呂建軍 周帥 宋石龍

1南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（南京210000）；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南京210000）；3南京中醫(yī)藥大學(xué)沭陽(yáng)附屬醫(yī)院（江蘇沭陽(yáng)223600）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種廣泛流行且進(jìn)展緩慢的退行性疾病，多累及膝、髖負(fù)重活動(dòng)關(guān)節(jié)，病理基礎(chǔ)以關(guān)節(jié)軟骨漸進(jìn)性退化，伴有骨贅生成、漸進(jìn)性關(guān)節(jié)功能喪失和軟骨下骨重塑為特征，屬于中醫(yī)“骨痹”范疇［1-2］。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）男性發(fā)病率為13.2%，女性發(fā)病率為28.3%，已經(jīng)成為最常見(jiàn)和最重要的關(guān)節(jié)疾病，同時(shí)據(jù)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率隨年齡增高而增高，40歲以下人群的發(fā)病率約為5%，60～75歲人群的發(fā)病率高于50%，50 歲以上骨關(guān)節(jié)炎患者的長(zhǎng)期致殘率名列第二［3］。有研究［4］表明我國(guó)目前癥狀性膝骨關(guān)節(jié)炎的患病率高達(dá)為8.1%。目前常見(jiàn)的治療藥物有非甾體抗炎藥、IL-1 抑制劑等［5］，其緩解疼痛效果好，但其副作用卻卻不可小覷，有報(bào)道［6］稱(chēng)美國(guó)每年因非甾體消炎藥導(dǎo)致死亡和住院總?cè)藬?shù)超過(guò)16 500人。近年來(lái)機(jī)制研究表明，白介素1（IL-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變關(guān)系密切。羌活桂枝膏是筆者導(dǎo)師多年治療膝骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，具有祛風(fēng)寒，除濕邪，溫經(jīng)脈的功效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化半定量分析檢測(cè)羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法對(duì)兔膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜IL-1 及MMP-9 的表達(dá)，進(jìn)一步探討羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法的作用機(jī)理，為該方進(jìn)行新藥開(kāi)發(fā)研制、走向市場(chǎng)提供一定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，同時(shí)為羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法治療KOA 提供實(shí)驗(yàn)支持。具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性新西蘭大白兔（平均兔齡為8 個(gè)月，平均體質(zhì)量2 kg）40 只，南京江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖廠(chǎng)提供，符合衛(wèi)生部一級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)（動(dòng)物許可證號(hào)scxk（蘇）2012-0008）。實(shí)驗(yàn)前詞養(yǎng)1 周，觀察無(wú)明顯全身疾病及其他異常后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。大白兔均飼養(yǎng)于室溫22～25 ℃，12/12 h 晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食與飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 羌活桂枝膏，江蘇省中醫(yī)院制劑部制備。藥物組成：羌活、桂枝。桂枝、羌活飲片均購(gòu)自于江蘇省中醫(yī)院藥學(xué)部，經(jīng)檢驗(yàn)符合中華人民共和國(guó)藥典2015 版一部之要求。

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備 木瓜蛋白酶（美國(guó)SIGMA），ELISA試劑盒（美國(guó)R&D），NO測(cè)定試劑盒（中國(guó)A012），自動(dòng)脫水機(jī)（中國(guó)JJ-12J），石蠟切片機(jī)（中國(guó)RM2016），攤片烤片機(jī)（中國(guó)KD-P），組織包埋中心（中國(guó)JB-P5），光學(xué)顯微鏡（日本Nikon Eclipse CI），電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國(guó)HPX-9052MBE）圖像采集系統(tǒng)（日本Nikon DS-U3），離心機(jī)（中國(guó)京立LD25-2），酶標(biāo)儀（瑞士TECAN），免疫組化試劑盒（中國(guó)MaxVisionTM），DAB顯色試劑（中國(guó)MaxVisionTM）。

1.4 研究設(shè)計(jì)

1.4.1 動(dòng)物模型 40 只兔按隨機(jī)數(shù)字表法分為分為正常對(duì)照組、模型組、推拿組、羌活桂枝膏貼敷、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組5 組，每組8 只。分別將0.5 mL 的2%木瓜蛋白酶水溶液于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第1、4、7 天注入兔右后肢膝關(guān)節(jié)制備家兔KOA 模型。造模結(jié)束1 周后，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M造模成功與否，造模成功標(biāo)準(zhǔn)：兔膝關(guān)節(jié)造模側(cè)出現(xiàn)腫脹，屈伸功能障礙為造模成功。

1.4.2 干預(yù)方法 正常對(duì)照組正常飼養(yǎng)，不做任何干預(yù)；模型組造模后正常飼養(yǎng)，固定右膝關(guān)節(jié)3 h；羌活桂枝膏貼敷組將羌活桂枝膏外敷于兔右膝關(guān)節(jié)，厚度約2 mm，面積3 cm × 5 cm，關(guān)節(jié)固定3 h，每日1 次；推拿組揉兔右膝關(guān)節(jié)髕骨周?chē)?，點(diǎn)按兔右膝委中、陽(yáng)陵泉、曲泉、犢鼻、足三里等穴位共約5 min，最后擦兔右膝關(guān)節(jié)，透熱為度，共計(jì)10 min，手法刺激以局部皮膚微紅為度；羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療組先將將羌活桂枝膏均勻涂抹于兔右膝關(guān)節(jié)周?chē)顾幐喑浞滞钙の?；揉兔右膝關(guān)節(jié)髕骨周?chē)?，點(diǎn)按兔右膝委中、陽(yáng)陵泉、曲泉、犢鼻、足三里等穴位共約5 min，最后擦兔右膝關(guān)節(jié)，透熱為度，共計(jì)10 min，手法刺激以局部皮膚微紅為度。

1.4.3 標(biāo)本采集與預(yù)處理 滑膜采集實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食禁水12 h，于治療結(jié)束后的第2 天，大體觀察各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的膝關(guān)節(jié)屈伸活動(dòng)度及關(guān)節(jié)腫脹情況。留取的右膝關(guān)節(jié)，以?xún)?nèi)側(cè)切口緩慢打開(kāi)膝關(guān)節(jié)腔行大體觀察，切取右膝關(guān)節(jié)滑膜，通過(guò)HE 染色方法觀察病理組織；使用IHC 法測(cè)定IL-1 及MMP-9 含量。

1.4.4 指標(biāo)檢測(cè)與方法 造模成功后觀察各組兔的精神狀態(tài)、體毛色澤、飲食等，對(duì)兔右膝關(guān)節(jié)屈伸功能障礙程度及腫脹程度等情況進(jìn)行評(píng)估。對(duì)滑膜組織行免疫組化IL-1 及MMP-9 半定量分析。

表1 桂枝羌活膏劑的性狀檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Characters of Qiang Huo Guizhi ointment

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以（）表示，符合正態(tài)性與方差齊性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，多組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物狀態(tài)觀察 從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膝關(guān)節(jié)屈伸功能障礙程度及腫脹程度大體觀察。膝關(guān)節(jié)屈伸功能障礙程度方面：正常對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)屈伸活動(dòng)度正常；羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組右側(cè)膝關(guān)節(jié)屈伸稍受限，但活動(dòng)度優(yōu)于推拿組、羌活桂枝膏貼敷組及模型組；推拿組和羌活桂枝膏貼敷組右側(cè)膝關(guān)節(jié)屈伸活動(dòng)度相仿但優(yōu)于模型組。膝關(guān)節(jié)腫脹程度方面：正常對(duì)照組雙側(cè)膝關(guān)節(jié)無(wú)腫脹；羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹不明顯，腫脹程度輕于推拿組、羌活桂枝膏貼敷組及模型組；推拿組和羌活桂枝膏貼敷組右側(cè)膝關(guān)節(jié)腫脹程度相仿但優(yōu)于模型組。

2.2 IL-1 半定量及免疫組化分析 見(jiàn)表2。IL-1在模型組、羌活桂枝膏貼敷組、推拿組的表達(dá)均較正常對(duì)照組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在正常對(duì)照組與羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏貼敷組、推拿組、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達(dá)較模型組均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組相較羌活桂枝膏貼敷表達(dá)低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在羌活桂枝膏貼敷組和推拿組表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。IL-1 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組治療后的膝OA 兔滑膜與正常對(duì)照組兔滑膜表達(dá)水平相似，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療膝OA兔療效顯著，對(duì)比單一推拿組及羌活桂枝膏貼敷療效更佳。見(jiàn)圖1。

2.3 MMP-9 半定量及免疫組化分析 見(jiàn)表3。MMP-9 在模型組、羌活桂枝膏貼敷組、推拿組、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組的表達(dá)均較正常對(duì)照組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MMP-9 在羌活桂枝膏貼敷組、推拿組、羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達(dá)較模型組均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MMP-9 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組與推拿組表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組表達(dá)較羌活桂枝膏貼敷組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。綜上可見(jiàn)，MMP-9 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療后的膝OA 兔滑膜與模型組差異顯著，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療兔膝OA 有效，同時(shí)羌活桂枝膏貼敷組與推拿療效相似。見(jiàn)圖2。

表2 膝OA 兔免疫組化IL-1 半定量分析Tab.2 Semi-quantitative analysis of IL-1 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

表2 膝OA 兔免疫組化IL-1 半定量分析Tab.2 Semi-quantitative analysis of IL-1 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

注：與模型組相比，aP ＜0.05；與羌活桂膏貼敷組相比，bP ＜0.05

組別正常組模型組羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組羌活桂枝膏貼敷組推拿組例數(shù)8 8 8 8 8 IL-1 平均光密度43.985 1±9.927 9 122.132 5±10.081 7 52.468 7±4.142ab 77.170 1±11.407 3a 69.428 4±10.703 8a

3 討論

3.1 祖國(guó)醫(yī)學(xué) 骨痹之名始見(jiàn)于《內(nèi)經(jīng)》，《素問(wèn)·痹論》有云：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹?！远龃苏邽楣潜?。”，《靈樞·氣穴論》記載：“積寒留舍，榮衛(wèi)不居，卷肉縮筋，肋肘不得伸，內(nèi)為骨痹?！?，《濟(jì)生方》曰：“骨痹之為病，應(yīng)乎腎，其狀骨重不可舉，不遂而痛且脹?！笨梢?jiàn)骨痹病機(jī)為風(fēng)、寒、濕邪困阻肌肉關(guān)節(jié)經(jīng)脈，同時(shí)腎主骨，骨痹的發(fā)生，與腎關(guān)系密切。羌活桂枝膏是筆者導(dǎo)師憑借多年治療KOA 的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成，組成為羌活及桂枝，羌活為傘形科植物羌活（Notopterygium incisum Ting ex H. T. Chang）的干燥根莖及根，歸腎、膀胱經(jīng)的功效，桂枝辛甘溫，有溫通經(jīng)脈，助陽(yáng)化氣之功效。桂枝來(lái)源于樟科植物肉桂（Cinnamomun cassia Presl）的干燥嫩枝。其辛、溫、甘，歸心、肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解肌、溫通經(jīng)脈、助陽(yáng)化氣、平?jīng)_降氣之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明它有抑菌、抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤、抗病毒、利尿、解熱、鎮(zhèn)痛、擴(kuò)張血管等多種藥理活性。桂枝是《傷寒論》中繼甘草臨床應(yīng)用第二多的藥物。兩藥相合，祛風(fēng)寒，除濕邪，溫經(jīng)脈以治療膝骨關(guān)節(jié)炎。

3.2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué) 現(xiàn)代研究表明骨關(guān)節(jié)炎中重要的病理學(xué)特征為——膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞功能減退和數(shù)量減少、軟骨基質(zhì)減少。保持軟骨細(xì)胞的健康狀態(tài)是防止關(guān)節(jié)軟骨退化的重要因素［7］。骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的退變主要通過(guò)兩條途徑而發(fā)揮作用［8］：一是通過(guò)各種因素導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)的破壞；二是軟骨細(xì)胞自身的退變，軟骨細(xì)胞的凋亡。

圖1 各組膝OA 兔滑膜IL-1 免疫組化Fig.1 Immunohistochemistry of IL-1 in synovium of knee OA rabbits

圖2 各組膝OA 兔滑膜MMP-9 免疫組化Fig.2 Immunohistochemistry of MMP-9 in synovium of knee OA rabbits

本研究中，MMP-9 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療后的膝OA 兔滑膜與模型組差異顯著，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療兔膝OA 有效，同時(shí)羌活桂枝膏貼敷組與推拿組療效相似。作為MMPs 家族的一員，有研究表明MMP-9 與的細(xì)胞外基質(zhì)降解過(guò)程有關(guān)，并在病理過(guò)程為纖維化的疾病中起重要作用。細(xì)胞因子IL-1β通過(guò)刺激軟骨細(xì)胞退變，引起基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族的產(chǎn)生，抑制Ⅱ型膠原的合成［9-10］。

表3 膝OA 兔免疫組化MMP-9 半定量分析Tab.3 Semi-quantitative analysis of MMP-9 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

表3 膝OA 兔免疫組化MMP-9 半定量分析Tab.3 Semi-quantitative analysis of MMP-9 in knee OA rabbits by immunohistochemistry ±s

注：與模型組相比，aP ＜0.05；與羌活桂膏貼敷組相比，bP ＜0.05

組別正常組模型組羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組羌活桂枝膏貼敷組推拿組例數(shù)8888 8 MMP-9 平均光密度30.270 8±6.780 3 134.118 1±10.464 5 51.867 7±12.264 0ab 82.479 7±15.505 8a 73.650 3±7.915 2a

有研究報(bào)道稱(chēng)細(xì)胞程序性死亡——自噬，是骨關(guān)節(jié)炎中調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞死亡的重要機(jī)制［11-12］IL-1為骨關(guān)節(jié)炎中主要的促炎癥因子，體外研究［13］發(fā)現(xiàn)IL-1 能顯著提高人軟骨細(xì)胞其mTOR 的表達(dá)，而明顯降低細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原的表達(dá)，眾多證據(jù)顯示骨關(guān)節(jié)炎軟骨退化伴有不同程度血管生成，源于關(guān)節(jié)軟骨和滑膜液中VEGF 水平上升［14］，而mTOR 受體的激活可刺激血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF 的表達(dá)［15］，由此推斷IL-1 可能在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞自噬過(guò)程中起到重要作用。同時(shí)IL-1β是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞降解的始動(dòng)因子，可以刺激基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大及細(xì)胞終末分化等細(xì)胞異化作用直接參與對(duì)軟骨的破壞［16］。IL-1 在羌活桂枝膏聯(lián)合推拿組治療后的膝OA 兔滑膜與正常對(duì)照組兔滑膜表達(dá)水平相似，提示羌活桂枝膏聯(lián)合推拿治療膝OA 兔療效顯著，對(duì)比單一推拿組及羌活桂枝膏貼敷療效更佳。

實(shí)驗(yàn)研究表明［17］：羌活膏能夠降低局部滑膜中炎癥因子來(lái)緩解膝骨關(guān)節(jié)炎的炎癥，從而緩解膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎癥狀。同時(shí)李華南等［18］人通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)：對(duì)患膝局部膏摩，能夠促進(jìn)藥物吸收，直達(dá)病所，改善局部血液循環(huán)，使炎性反應(yīng)加快消散吸收。

本研究結(jié)果初步證實(shí)了羌活桂枝膏聯(lián)合推拿手法可膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)延緩膝關(guān)節(jié)軟骨退變，降低炎性因子IL-1 及基質(zhì)金屬蛋白酶-9 的表達(dá)。而能否通過(guò)降低IL-1 水平，從而調(diào)節(jié)mTOR 受體，進(jìn)一步抑制VEGF 表達(dá)，增加軟骨細(xì)胞外基質(zhì)合成、提高軟骨細(xì)胞自噬、減少血管生成，協(xié)同作用以減緩骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展承待進(jìn)一步研究。