孫朝陽，周坤*，馬翔

(1陜西省安康市中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，安康 725000；2新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心，烏魯木齊 830054)

冠心病(coronary heart disease，CHD)是由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化造成的冠狀動(dòng)脈供血相對(duì)不足，進(jìn)而造成心肌缺氧、缺血，導(dǎo)致的心臟疾病[1]。有報(bào)道指出，藥物可通過降低心肌耗氧抑制鈣超載、清除氧自由基、抑制細(xì)胞凋亡、促血管生成等不同途徑起到抗心肌缺血的作用。氧化應(yīng)激在心力衰竭與心肌缺血/再灌注損傷等心臟病變中發(fā)揮重要作用[2]。腦和心臟等器官易受缺氧缺血損傷，最終通過影響線粒體功能造成心肌細(xì)胞死亡或凋亡[3]，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)開放是缺血/再灌注損傷導(dǎo)致線粒體損傷并最終致細(xì)胞死亡的關(guān)鍵。線粒體ATP敏感性鉀離子通道(mitochondrial ATP-sensitive potassium channels，mitoKATP)與MPTP 間存在關(guān)聯(lián)。目前，抑制MPTP開放被認(rèn)為是治療缺血/再灌注損傷的關(guān)鍵點(diǎn)[4]。有報(bào)道指出，二氮嗪作為mitoKATP的開放劑，可通過激活內(nèi)源性心肌保護(hù)機(jī)制，起到抗心肌缺血缺氧損傷的作用[5-7]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

清潔級(jí)健康SD大鼠共40只，雌雄各20只，體質(zhì)量(220±20)g。由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。將40只SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(不造模且不給予二氮嗪藥物干預(yù))、假手術(shù)組(僅切皮不進(jìn)行造模手術(shù))、模型組(制作冠心病大鼠模型，但不給予二氮嗪藥物干預(yù))和藥物組(制作冠心病大鼠模型，給予二氮嗪3 mg/kg干預(yù))，每組10只。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及干預(yù)方法 大鼠麻醉后固定，氣管插管，連接人工動(dòng)物呼吸機(jī)支持呼吸， 從胸骨左側(cè)第3、4肋間正中線旁開5 mm行縱向切口， 于心臟左心耳根部下方2～3 mm處穿線，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支，建立心肌缺血模型。結(jié)扎后迅速將心臟還納，關(guān)閉胸腔，恢復(fù)自主呼吸。以術(shù)后Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段弓背向上抬高為造模成功的標(biāo)志。造模1周后開始灌胃給藥，藥物組給予二氮嗪3 mg/kg，正常對(duì)照組、假手術(shù)組和模型組灌胃同體積的生理鹽水，1次/d，共4周。給藥結(jié)束后禁食12 h，不禁水。利用多導(dǎo)生理檢測(cè)儀對(duì)心功能和冠狀動(dòng)脈血流量進(jìn)行測(cè)定，以頸椎脫臼的方式處死大鼠，取心臟，去掉心房和右心室，將左心室保存于-80℃下。

1.2.2 心功能測(cè)定 (1)由房室瓣插入球囊，接壓力換能器，連接Power-Lab血流動(dòng)力學(xué)信號(hào)采集與分析系統(tǒng)，記錄左心室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室內(nèi)壓最大變化速率(最大上升速率：+dp/dtmax；最大下降速率：-dp/dtmax)。(2)分離冠狀動(dòng)脈左旋支根部，放置微型電磁流量計(jì)探頭，檢測(cè)冠狀動(dòng)脈血流量(coronary flow，CF)。

1.2.3 成纖維細(xì)胞生長因子2和血管內(nèi)皮生長因子mRNA的檢測(cè) 采用總RNA提取試劑盒(Takara公司)對(duì)各組中的總RNA進(jìn)行提取，具體操作如下。取新鮮血液，加紅細(xì)胞裂解液(1∶3，v/v)，充分混勻，靜置10 min，10 000轉(zhuǎn)/min離心1 min。棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。加入1 ml TRIzol，充分混勻后，室溫放置5 min，使樣品充分裂解，4℃ 12 000轉(zhuǎn)/min離心10～15 min。收集上清，加入冰冷的異丙醇(1∶1，v/v)，混勻，靜置10～20 min，4℃ 12 000轉(zhuǎn)/min離心10 min，收集水相層(約550 μl)，轉(zhuǎn)移到新的無酶離心管中，離心棄上清，向沉淀中加入50～100 μl RNase-free水，輕彈管壁，以充分溶解RNA。分別對(duì)各mRNA引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，詳見表1。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分析反應(yīng)體系為20 μl。反復(fù)混勻點(diǎn)甩后，置于熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性10～15 min，95℃變性5～20 s，55℃～60℃退火，30～40 s，40個(gè)循環(huán)。將得到的Ct值，帶入2-△△Ct，計(jì)算成纖維細(xì)胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，F(xiàn)GF-2)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.2.4 細(xì)胞總蛋白的提取 按照凱基全蛋白提取試劑盒操作說明進(jìn)行。每1 ml裂解液中加入5 μl磷酸酶抑制劑、1 μl蛋白酶抑制劑和5 μl苯甲基磺酰氟(100 mmol/L)，混勻冰上保存。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液， 預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細(xì)胞2次，加入裂解液，冰上孵育15 min，將細(xì)胞刮下，轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4℃ 10 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，置于-80℃保存。

表1 RT-PCR引物序列設(shè)計(jì)結(jié)果

RT-PCR: reverse transcription-polymerase chain reaction; FGF-2: fibroblast growth factor-2; VEGF: vascular endothelial growth factor.

1.2.5 Western blotting 按照碧云天SDS-PAGE凝膠配制試劑盒操作說明配置凝膠。根據(jù)目的蛋白分子量大小選用10%的分離膠和5%的濃縮膠。加入一抗(小鼠抗大鼠FGF-2單克隆抗體；兔抗小鼠VEGF多克隆抗體；兔抗小鼠乳酸脫氫酶多克隆抗體)，稀釋度均為1∶400，孵育時(shí)間為2 h。將制備好的凝膠放入電泳槽中，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，之后分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜與雜交。

1.2.6 心肌細(xì)胞培養(yǎng)及氧化應(yīng)激損傷模型建立 在無菌條件下，開胸取出心臟，剪心室肌，用預(yù)冷的D-Hank′s沖洗3次，剪碎至糊狀，加含 0.125%胰蛋白酶消化液4～5 ml，37℃消化3 min，靜置 1 min，棄上清，加入5 ml消化液，消化7 min，于室溫靜置1 min。收集上清，加入同體積含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化。1 000轉(zhuǎn)/min離心4 min，以DMEM培養(yǎng)液(含15%胎牛血清)重懸，重復(fù)3～5 次后轉(zhuǎn)移至100 ml培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)前2天加阿糖胞苷抑制非心肌細(xì)胞貼壁生長。待細(xì)胞長滿瓶底后傳代，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為 4×105個(gè)/孔。將模型組與藥物組的心肌細(xì)胞通過500 μmol/L過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)進(jìn)行處理，37℃孵育2 h。應(yīng)用100 μmol/L H2O2培養(yǎng)16 h以復(fù)制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。

1.2.7 乳酸脫氫酶、線粒體膜電位和細(xì)胞死亡率的測(cè)定 各組細(xì)胞經(jīng)處理后，根據(jù)試劑盒步驟，通過生化自動(dòng)分析儀檢測(cè)乳酸脫氫酶活性。細(xì)胞經(jīng)處理后，向培養(yǎng)皿中加入1 ml PBS，充分混勻，加入終濃度為5 μmol/L的Rh-123，37℃避光10 min，EDTA-胰酶消化，1 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，棄上清，PBS沖洗1次，加10 ng/ml PI，充分混勻，流式細(xì)胞儀測(cè)各孔的熒光強(qiáng)度(各份樣品計(jì)數(shù)大于10 000個(gè)細(xì)胞)。Rh-123的發(fā)射波長為525 nm、激發(fā)波長為488 nm；PI 的發(fā)射波長為 675 nm、激發(fā)波長為488 nm。計(jì)算各區(qū)域細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度以及百分比，評(píng)價(jià)細(xì)胞的線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)及其死亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能變化比較

與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax和CF顯著下降(P<0.05)。與模型組比較，藥物組的LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax和CF顯著增加(P<0.05；表2)。

2.2 各組大鼠心臟中細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較

通過測(cè)定血清中免疫細(xì)胞因子FGF-2和VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平，判斷各組血管生長因子的生長情況。由結(jié)果可以看出，與正常組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠FGF-2與VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著增加(P<0.05)，而與模型組相比，藥物組大鼠FGF-2 mRNA與VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(P<0.05；表3)。

2.3 各組大鼠生長因子蛋白表達(dá)量和心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶的變化

通過Western blotting實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠心臟FGF-2及VEGF蛋白表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖1。

表2 各組大鼠心功能變化比較

LVSP: left ventricular systolic pressure; +dp/dtmax: maximum rate of left ventricular pressure rise; -dp/dtmax: maximum rate of left ventricular pressure decline; CF: coronary flow. Compared with control group,*P<0.05; compared with sham operation group,#P<0.05; compared with model group,△P<0.05. 1 mmHg=0.133 kPa.

將各條帶的灰度值進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果表明，與正常組和假手術(shù)組相比，模型組大鼠FGF-2與VEGF 蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)；與模型組相比，藥物組大鼠FGF-2與VEGF表達(dá)水平降低(P<0.05)。500 μmol/L H2O2作用于心肌細(xì)胞2 h后，結(jié)果表明，與正常組和假手術(shù)組相比，模型組中乳酸脫氫酶表達(dá)增加(P<0.05)，表明膜通透性增加，而與模型組相比，預(yù)先用二氮嗪處理的藥物組的乳酸脫氫酶表達(dá)降低(P<0.05；表4)，由此推測(cè)，二氮嗪對(duì)抗H2O2誘導(dǎo)的乳酸脫氫酶增加可能與激活的mitoKATP有關(guān)。

表3 各組大鼠心臟中FGF-2與VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平的比較

FGF-2: fibroblast growth factor 2; VEGF: vascular endothelial growth factor. Compared with control group,*P<0.05; compared with sham operation group,#P<0.05; compared with model group,△P<0.05.

圖1 各組大鼠心臟FGF-2及VEGF蛋白表達(dá)量

FGF-2: fibroblast growth factor 2; VEGF: vascular endothelial growth factor.

表4各組大鼠生長因子蛋白和心肌細(xì)胞LDH表達(dá)量

Table 4 Comparison of expression of FGF-2, VEGF and LDH among groups (n=10)

GroupFGF-2VEGFLDH(U/L)Control0.72±0.130.81±0.2140.13±1.14Sham opera-tion0.80±0.230.75±0.2139.20±2.22Model1.32±0.33*#1.20±0.13*#156.12±10.18*#Drug0.69±0.33△0.68±0.33△49.32±3.51△

FGF-2: fibroblast growth factor 2; VEGF: vascular endothelial growth factor; LDH: lactate dehydrogenase. Compared with control group,*P<0.05; compared with sham operation group,#P<0.05; compared with model group,△P<0.05.

2.4 心肌細(xì)胞MMP和死亡率與H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的關(guān)聯(lián)

與正常組和假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞MMP和死亡率增加(P<0.05)，而Rh-123熒光強(qiáng)度降低(P<0.05)。與模型組相比，藥物組細(xì)胞MMP和死亡率降低(P<0.05)，而Rh-123熒光強(qiáng)度增加(P<0.05；圖2,表5)。

圖2 過氧化應(yīng)激損傷對(duì)心肌細(xì)胞MMP的影響

Group Cell death rate(%)Fluorescence intensityControl28.33±2.20820.10±5.15Sham opera-tion29.20±2.23816.25±4.17Model66.12±3.23*# 220.24±6.15*#Drug30.32±3.48△780.12±9.20△

MMP: mitochondrial membrane potential. Compared with control group,*P<0.05; compared with sham operation group,#P<0.05; compared with model group,△P<0.05.

3 討 論

二氯嗪又名氯甲苯噻，英文名diazoxide，分子式C8H7ClN2O2S，是由5-氯-2-乙酰胺基-N-乙酰基苯磺酰胺經(jīng)高溫環(huán)合而得。該藥物可從清除氧自由基、降低心肌耗氧、促血管生成、抑制鈣超載、抑制細(xì)胞凋亡等多種途徑起到抗心肌缺血的效果。mitoKATP通道分布于血管、骨骼肌、胰腺、神經(jīng)元等組織，在細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)機(jī)制中可能具有重要作用，在缺血預(yù)適應(yīng)及缺血后適應(yīng)心肌保護(hù)機(jī)制中起到關(guān)鍵作用[8]。研究表明，二氮嗪作為mitoKATP開放劑，具有抗心肌缺血缺氧損傷作用。本實(shí)驗(yàn)表明，二氮嗪可促進(jìn)LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的絕對(duì)值、CF增加，且FGF-2和VEGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低。有研究表明，在新血管形成的過程中，有諸多血管生長因子參與調(diào)節(jié)，F(xiàn)GF-2和VEGF是最強(qiáng)有力的2種血管生成因子。FGF-2可刺激蛋白酶原活化因子與內(nèi)皮細(xì)胞分泌蛋白酶，從而導(dǎo)致血管基底膜降解，使細(xì)胞侵入周圍基質(zhì)，從而形成新的、具有空腔的血管[9,10]。VEGF能夠特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂及增殖，促進(jìn)血管生成，增強(qiáng)血管通透性，使血管內(nèi)成分滲漏，為血管形成與內(nèi)皮遷移提供基質(zhì)[11,12]。

有關(guān)報(bào)道指出，缺血心肌組織可釋放大量自由基，而活性氧自由基在缺血再灌注的心肌損傷中具有十分重要的作用。H2O2是體內(nèi)氧化代謝的中間產(chǎn)物，當(dāng)其大量積聚時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生毒性。本研究采用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激性損傷，建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。Rh-123是一種陽離子親脂性熒光染料，可使膜產(chǎn)生通透性，活細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜存在跨膜電位，故能特異地聚集在線粒體，Rh-123熒光強(qiáng)度降低表明線粒體數(shù)量降低或MMP降低和喪失。PI是分子量較大的一種化合物，不能進(jìn)入細(xì)胞膜，細(xì)胞膜遭到破壞或細(xì)胞死亡時(shí)，PI可較快地進(jìn)入細(xì)胞，與DNA和RNA在核著染，因此可根據(jù)PI的著染情況，評(píng)價(jià)細(xì)胞的死亡情況[13]。本研究利用流式細(xì)胞儀結(jié)合Rh-123和PI雙標(biāo)記法準(zhǔn)確檢測(cè)MMP，從而反映細(xì)胞存活狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，500 μmol/L H2O2作用2 h后，大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶活性增強(qiáng)，MMP下降，細(xì)胞存活率降低，由此表明，H2O2導(dǎo)致了心肌細(xì)胞受損；二氮嗪干預(yù)后，乳酸脫氫酶活性降低，MMP和細(xì)胞存活率增高。研究表明，二氮嗪可通過激活線粒體KATP通道介導(dǎo)的信號(hào)通路，對(duì)H2O2造成的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷起到保護(hù)作用。

綜上所述，mitoKATP通道開放劑可緩解冠心病大鼠心肌氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制與緩解FGF-2和VEGF過度上調(diào)有關(guān)。