弓 強(qiáng), 張希春

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 山西 晉中 030619;2.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院, 山西 晉中 030619

人胃腸道微生物菌群在低鐵濃度的胃腸道環(huán)境中獲取鐵資源的主要策略是依靠分泌一類具有螯合、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯藏鐵元素功能的鐵載體蛋白[1,2]。目前已知的鐵載體蛋白有500多種，主要分為3大類：兒茶酚類(catecholates)、異羥肟酸類(hydroxamaces)、羧酸鹽類(carboxylates)[3]，其中兒茶酚類鐵載體的螯合能力最強(qiáng)。兒茶酚類鐵載體屬于非核糖體肽，由NRPS參與合成。NRPS是一類具有模塊化結(jié)構(gòu)域的巨型酶系[4]，其腺嘌呤結(jié)構(gòu)域(adenine domain，A domain)具有底物識別特異性，可以根據(jù)其氨基酸序列預(yù)測NRPS合成產(chǎn)物的功能和類型[5～8]。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)鐵載體在預(yù)防和治療胃腸道疾病中顯示出了獨(dú)特功效。產(chǎn)鐵載體微生物不僅在胃腸道低鐵環(huán)境中表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)性[9]，還可與致病菌競爭鐵元素從而抑制致病微生物的生長[10]。另有研究表明，產(chǎn)鐵載體微生物可以作為補(bǔ)鐵劑對一些自身無法合成鐵載體的微生物(如乳酸桿菌、雙歧桿菌)發(fā)揮益生作用，顯著提高其數(shù)量和生長速率，從而維持胃腸道內(nèi)菌群的平衡[11,12]。此外，鐵載體在植物營養(yǎng)與保護(hù)[13～15]、魚病防治[16,17]和醫(yī)療[18,19]等方面亦發(fā)揮著重要作用。

目前，鐵載體高產(chǎn)菌株的分離篩選多來自海洋和植物根際土壤，而從成人糞樣中分離篩選人胃腸道源鐵載體高產(chǎn)菌株的相關(guān)研究較少。因此，本研究從健康成人糞樣中篩選含NRPS A domain基因的陽性菌株入手，分析其產(chǎn)鐵載體能力，以期為兒茶酚類鐵載體產(chǎn)生菌在人胃腸道營養(yǎng)與健康中作用的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和載體

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司；載體pMD19-T購自日本TaKaRa公司。

1.2 主要試劑和儀器

胃蛋白酶(豬源，1∶3000)、胰酶(豬源，USP級)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；豬膽鹽(BR級)購自國藥集團(tuán)；細(xì)菌全基因組提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker (DL2000)、T4連接酶、TaqDNA聚合酶試劑盒均購自日本TaKaRa公司；核酸染料Gold View-II購自北京賽百盛公司；氨芐青霉素(Ampicilline)、瓊脂糖(agarose)購自德國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

PTC-200型PCR儀、Elddlxr型凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司；EPS-300型核酸電泳儀購自上海天能科技有限公司；UV-2600AH型分光光度計(jì)購于尤尼柯(上海)儀器有限公司。

1.3 主要溶液和培養(yǎng)基

模擬胃液(1 000 mL)：蛋白胨8.3 g，葡萄糖3.5 g，氯化鈉6.2 g，氯化鉀2.2 g，氯化鈣0.22 g，碳酸氫鈉1.2 g，胃蛋白酶3.0 g，加蒸餾水定容至1 000 mL,pH 1.8，充分溶解后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。

模擬腸液(1 000 mL)：蛋白胨8.3 g，葡萄糖3.5 g，氯化鈉1.28 g，氯化鉀0.24 g，碳酸氫鈉6.4 g，膽鹽3.0 g，胰酶1.0 g，加蒸餾水定容至1 000 mL,pH 7.5，充分溶解后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。

MRS去鐵液體培養(yǎng)基(1 000 mL)：蛋白胨10.0 g，葡萄糖10.0 g，酵母提取物5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸氫二胺2.0 g，七水合硫酸鎂0.2 g，五水硫酸錳0.05 g，8-羥基喹啉0.05 g，加蒸餾水定容至1 000 mL,pH 7.0～7.2,用等體積氯仿萃取2次，棄去氯仿層，121℃滅菌21 min。固體MRS去鐵培養(yǎng)基另加15.0 g瓊脂粉。

BHI培養(yǎng)基(1 000 mL)：牛腦200.0 g，牛心浸出汁250.0 g，蛋白胨10.0 g，葡萄糖2.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.8～7.2，121℃高壓滅菌15 min。

琥珀酸培養(yǎng)基(1 000 mL)：磷酸氫二鉀6.0 g，琥珀酸4.0 g，磷酸二氫鉀3.0 g，硫酸銨1.0 g，硫酸鎂0.1 g，加蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌21 min。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1菌株的分離 志愿者為1名健康的成年在校女性大學(xué)生，無任何胃腸道相關(guān)疾病，采樣前2周內(nèi)未使用任何藥物。收集其1 g新鮮糞便樣品快速加入10 mL無菌生理鹽水中，震蕩混勻，4℃、10 000 r/min離心5 min,隨后取1 mL上清液并加入9 mL模擬胃液，37℃培養(yǎng)4 h；再向培養(yǎng)菌液中加入40 mL模擬腸液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)18 h，用于菌株的分離。

取200 μL菌液分別涂布在不同的培養(yǎng)基(MRS、BHI培養(yǎng)基)中，37℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行初篩。初篩后的菌落在半固體培養(yǎng)基深層接種，挑取在表層和穿刺線均有生長的單菌落，進(jìn)行甘油保種，于-20℃儲存。

1.4.2含NRPS A domain基因菌株的篩選 按細(xì)菌全基因組提取試劑盒的操作說明書提取純化后菌株的全基因組，于-20℃儲存?zhèn)溆?。利用CODEHOP軟件[20]設(shè)計(jì)針對人胃腸道源微生物且代謝產(chǎn)物為兒茶酚類鐵載體的NRPS A domain基因的簡并引物F2(5′-GGCAAACCGAAAGGNGTNATGRT-3′)、AR1(5′-GCTTCAATYTCRCMYARYTC-3′)，交由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成。以全基因組為模板篩選含NRPS A domain基因的微生物。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.1 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 17.4 μL。反應(yīng)條件：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 45 s，72℃ 105 s，共35個循環(huán)；72℃ 7 min。利用1.2%(w/V)瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，目的片段大小應(yīng)為800 bp左右，以此篩選含NRPS A domain基因的陽性菌株。

1.4.3NRPS A domain陽性菌株的鑒定 利用通用引物27F/1492R擴(kuò)增NRPS A domain陽性菌株的16S rRNA基因，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后與pMD19-T載體連接，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌株交至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

將去除載體序列的16S rRNA基因以NCBI在線Blast比對進(jìn)行菌株分類地位的初步分析，下載相似度較高的16S rRNA基因序列作為系統(tǒng)發(fā)育分析的參比序列，利用Clustal W軟件進(jìn)行比對，利用MEGA 5.2軟件(采用Neighbor-Joining法，設(shè)置Bootstrap為1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[21]。將16S rRNA基因序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.4.4NRPS A domain基因產(chǎn)物的分析 擴(kuò)增陽性菌株的NRPS A domain基因，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與pMD19-T載體連接后導(dǎo)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌株提取質(zhì)粒，將回收質(zhì)粒交至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

去除測序結(jié)果中的載體序列，利用NCBI中的CDD(conserved domain database)軟件進(jìn)行分析，驗(yàn)證測序結(jié)果是否為NRPS腺嘌呤結(jié)構(gòu)域基因序列。利用NCBI中的ORF(open reading frame)Finder軟件將核酸序列翻譯為氨基酸序列；再以UniProtKB/Swiss-Prot在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行氨基酸序列分析，下載相似度較高的NRPS A domain氨基酸序列作為參比序列，利用Clustal W軟件進(jìn)行比對，利用MEGA 5.2軟件(采用Neighbor-Joining法，設(shè)置Bootstrap為1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，預(yù)測NRPS次級代謝產(chǎn)物的化合物類型[21]。將NRPS A domain氨基酸序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.4.5兒茶酚類鐵載體產(chǎn)量的測定 利用Rioux比色法測定兒茶酚類鐵載體的產(chǎn)量[22]。將活化后的菌液以3%(V/V)的接種量接種于10 mL琥珀酸培養(yǎng)基中，37℃搖床(180 r/min)培養(yǎng)36 h。12 000 r/min離心30 min，取上清液。配制5 mL的反應(yīng)體系:2.3 mL無菌超純水，0.2 mL 20%硫酸溶液，1 mL上清液，0.1 mL 1%檸檬酸鐵胺溶液，0.4 mL 2 mol/L氟化銨溶液，0.4 mL 1%鄰二氮菲溶液，0.6 mL 3 mol/L四氮環(huán)六亞甲基溶液。充分混勻后60℃水浴1 h，冷卻至室溫后于510 nm處測定吸光值。設(shè)置空白組為未接種的琥珀酸培養(yǎng)基；修正組用無菌超純水替換鄰二氮菲溶液，其他條件不變，以消除培養(yǎng)基的干擾。每組設(shè)置3次重復(fù)。用兒茶酚標(biāo)準(zhǔn)品配制不同濃度梯度的兒茶酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制510 nm處兒茶酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)兒茶酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算兒茶酚類鐵載體產(chǎn)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(Anova)，以P<0.05為存在顯著性差異，并用Duncan檢驗(yàn)法作多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 含NRPS A domain基因的陽性菌株

研究分離得到21株人胃腸道源兼性厭氧微生物，對其兒茶酚類鐵載體生物合成途徑NRPS A domain基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，共獲得8株陽性菌株，分別命名為Gut 01、Gut 03、Gut 07、Gut 12、Gut 13、Gut 14、Gut 16、Gut 20(圖1)。

圖1 NRPS A domain擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 PCR amplification of NRPS A domain gene.注：M：DNA DL-2000 marker；01、 03、07、12、13、14、16、20：菌株Gut01、Gut03、Gut07、Gut12、Gut13、Gut14、Gut16、Gut20 NRPS A domain基因擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 陽性菌株的種屬

陽性菌株的16S rRNA基因序列比對分析結(jié)果如表1所示，Gut 01、Gut 07、Gut 12、Gut 13、Gut 20分別與E.coliE191-4 (KJ477005.1)、E.coliO157:H7 strain WS4202 (CP012802.1)、E.coliE84-1(KJ477001.1)、E.coliRCB273(KT260485.1)、E.coliK-12 strain DHB4 (CP014270.1)的16S rRNA基因序列的相似度最高(99%)；Gut 03、Gut 14、Gut 16分別與BacilluscereusBQAR-01d(FJ217203.1)、Bacillussp. B31(2008)(EU384285.1)、B.cereusS2-8(CP009605.1)的相似度最高，分別為93%、93%、99%。

下載相似度較高的相關(guān)菌株16S rRNA基因序列，用MEGA 5.2軟件構(gòu)建16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，Gut 01、Gut 07、Gut 12、Gut 13、Gut 20在進(jìn)化關(guān)系上與埃希氏菌屬微生物在同一分支，具有同源性(圖2)，說明這5株菌株為埃希氏菌屬的新種或亞種；菌株Gut 16與B.cereusS2-8CP009605.1)在同一分支上，具有同源性，且其16S rRNA基因序列相似度為99%，因此將其命名為B.cereusGut 16；菌株Gut 03、Gut 14與Bacillussp. B31(2008)(EU384285.1)、B.cereusBQAR-01d(FJ217203.1)在同一分支具有同源性，且與其同源性菌株16S rRNA基因序列相似度為93%，由此可判斷Gut 03、Gut 14是芽孢桿菌屬的新種或亞種，因此命名為Bacillussp. Gut 03和Bacillussp. Gut 14。

表1 16S rRNA基因序列比對分析Table 1 Similarity to the closest relatives in GenBank of 16S rRNA gene sequences of isolates.

圖2 篩選菌株基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of selected strains.注：圖中分支點(diǎn)的數(shù)字代表樹形可信度，即1 000次聯(lián)配中成功的百分比；括號內(nèi)序列號為菌株的GenBank登錄號；標(biāo)尺代表序列間的分歧度，即遺傳距離；▲為實(shí)驗(yàn)菌株；右側(cè)為同一分支微生物的種屬。

(

將8株菌株的16S rRNA基因序列測序結(jié)果提交至NCBI，得到GenBank的序列登錄號為KU156682～KU156689。

2.3 陽性菌株的產(chǎn)物預(yù)測

陽性菌株的NRPS A domain基因測序結(jié)果經(jīng)CDD軟件驗(yàn)證，擴(kuò)增產(chǎn)物屬于NRPS A domain基因保守序列；再將核酸序列翻譯為氨基酸序列，與UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫比對分析，結(jié)果如表1所示；再利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖3)。由結(jié)果可知，Gut 14和Gut 16的NRPS A domain結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與菌株B.subtilis168 (P45745)的NRPS中DHB F結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的相似度最高，分別為81.4%和81.3%，且在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中具有同源性。DHB F結(jié)構(gòu)域是芽孢桿菌屬菌株中參與芽孢桿菌素合成的重要功能結(jié)構(gòu)域[23]，因此，Gut 14和Gut 16由NRPS參與合成的兒茶酚類鐵載體為芽胞桿菌素。而Gut 01、Gut 03、Gut 07、Gut 12、Gut 13、Gut 20的NRPS A domain氨基酸序列在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中處于同一分支(圖3)，與參與合成腸桿菌素的Ent F結(jié)構(gòu)域具有同源性，其相似度為97.7%～99.2%，因此，Gut 01、Gut 03、Gut 07、Gut 12、Gut 13、Gut 20由NRPS合成的兒茶酚類鐵載體為腸桿菌素。

圖3 篩選菌株基于NRPS A domain氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on NRPS A domain amino acid sequences of selected strains.注：圖中分支點(diǎn)的數(shù)字代表樹形可信度，即1 000次聯(lián)配中成功的百分比；括號內(nèi)序列號為菌株的NRPS A domain氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫UniProt-KB/Swiss-Prot的登錄號；標(biāo)尺代表序列間的分歧度，即遺傳距離；▲為實(shí)驗(yàn)菌株；右側(cè)為次級代謝產(chǎn)物預(yù)測的化合物類型。

將8株菌的NRPS A domain結(jié)構(gòu)域氨基酸序列提交至NCBI，得到GenBank中的序列登錄號為KU156690～KU156697。

2.4 陽性菌株產(chǎn)兒茶酚類鐵載體的能力

Rioux比色法定量測定兒茶酚類鐵載體產(chǎn)量，結(jié)果顯示8株菌株均有兒茶酚類鐵載體產(chǎn)生；由表2可知，B.cereusGut 16 產(chǎn)芽胞桿菌素能力最強(qiáng)(94.75±0.40 μmol/L)，E.coliGut 07產(chǎn)腸桿菌素能力最強(qiáng)(66.48±0.10 μmol/L)，均顯著高于其他菌株(P<0.05)。

表2 兒茶酚類鐵載體的產(chǎn)量Table 2 The yield of cateloate-type siderophore.

注：同一列內(nèi)不同字母表示數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

人胃腸道微生物菌群處在一個高度特殊化的環(huán)境中，因其龐大的生物量與基因資源，具有許多人體自身不具備的代謝功能，對人體的營養(yǎng)和健康產(chǎn)生直接或間接影響。本研究通過克隆兒茶酚類鐵載體生物合成途徑中NRPS的基因，根據(jù)NRPS A domain底物特異性預(yù)測代謝產(chǎn)物的化合物類型，并結(jié)合理化實(shí)驗(yàn)對產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，最終篩選得到8株人胃腸道源產(chǎn)兒茶酚類鐵載體菌株?；谏镄畔W(xué)方法預(yù)測NRPS次級代謝產(chǎn)物兒茶酚類鐵載體的化合物類型，8株菌的合成產(chǎn)物分別為腸桿菌素和芽孢桿菌素。利用化學(xué)方法對8株菌株的兒茶酚類鐵載體產(chǎn)量研究表明，其生成兒茶酚類鐵載體的能力具有顯著性差異(P<0.05)，菌株B.cereusGut 16生成芽胞桿菌素的能力最強(qiáng)(94.75±0.40 μmol/L)，菌株E.coliGut 07生成腸桿菌素的能力最強(qiáng)(66.48±0.10 μmol/L)。

武漢大學(xué)趙翔等[24]從湖水中篩選得到1株高產(chǎn)鐵載體熒光假單胞菌，其培養(yǎng)上清液中鐵載體的產(chǎn)量達(dá)到15 μmol/L，產(chǎn)量小于本實(shí)驗(yàn)得到的產(chǎn)兒茶酚類鐵載體菌株，其原因可能是因?yàn)槲⑸飦碓床煌?，胃腸道環(huán)境與湖水中環(huán)境差異較大。E.coliGut 01、E.coliGut 07、E.coliGut 12、E.coliGut 13、E.coliGut 20的NRPS A domain結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)化關(guān)系顯示與16S rRNA基因序列分析結(jié)果一致，說明NRPS A domain結(jié)構(gòu)域具有高度保守性；Bacillussp. Gut 03的NRPS A domain結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)化關(guān)系顯示與埃希氏菌屬微生物具有同源性(圖3)，說明NRPS A domain結(jié)構(gòu)域氨基酸序列可以用來預(yù)測其次級代謝產(chǎn)物的化合物類型，而不能準(zhǔn)確反映物種間的進(jìn)化關(guān)系。Fiedler等[25]研究發(fā)現(xiàn)，腸桿菌素并非只能由革蘭氏陰性菌合成，革蘭氏陽性菌也能夠分泌腸桿菌素，與本研究中革蘭氏陽性菌Bacillussp. Gut 03合成的兒茶酚類鐵載體為腸桿菌素結(jié)果一致。

兒茶酚類鐵載體在胃腸道中分布廣泛，如耶爾森菌、沙門氏菌、假單胞菌、弧菌等分泌的耶爾森菌素、沙門氏菌素、假單胞菌素和弧菌素都屬于兒茶酚類鐵載體，但是其對人胃腸道營養(yǎng)與健康的影響尚缺乏統(tǒng)一的認(rèn)識。本研究得到的兒茶酚類鐵載體高產(chǎn)菌株為芽孢桿菌屬和埃希氏菌屬，這一結(jié)果可能與芽孢桿菌和大腸桿菌在胃腸道環(huán)境中的作用和地位直接相關(guān)，作為胃腸道微生物菌群中的優(yōu)勢菌群，其不僅可以為自身生長提供所需的鐵元素，而且可以作為胃腸道微生物菌群中鐵資源的供體菌，為胃腸道微生物菌群的生長提供鐵資源，維持胃腸道微生物菌群的多樣性[26]。

本研究利用兒茶酚類鐵載體生物合成途徑NRPS的基因以篩選產(chǎn)兒茶酚類鐵載體菌株，可以有效提高篩查的準(zhǔn)確性與高效性，而且對于特定次級代謝產(chǎn)物微生物的篩選，較傳統(tǒng)的篩選方法更具優(yōu)勢。本研究獲得的兒茶酚類鐵載體高產(chǎn)菌株為兒茶酚類鐵載體及其產(chǎn)生菌在食品、醫(yī)藥和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為其在胃腸道營養(yǎng)與健康中作用的研究奠定了基礎(chǔ)。