倪爽 苗澤遠(yuǎn) 王家昕 王曉霞 李潔 王子鈺 魏會平 董明綱 蘇立寧

1.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院麻醉專業(yè)，張家口，075000，中國

2.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床專業(yè)，張家口，075000，中國

3.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院口腔專業(yè)，張家口，075000，中國

4.河北北方學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物教研室，張家口，075000，中國

5.河北北方學(xué)院學(xué)報編輯部，張家口，075000，中國

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來源于骨髓組織，是治療神經(jīng)損傷、神經(jīng)系統(tǒng)退行性等疾病的種子細(xì)胞，具有取材容易、可分化為神經(jīng)細(xì)胞等特點。神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)元的發(fā)育、死亡、修復(fù)、軸突再生、突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)等神經(jīng)系統(tǒng)活動中發(fā)揮重要作用。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）對神經(jīng)元起保護(hù)、促進(jìn)再生等作用。BDNF 能維持中腦多巴胺能神經(jīng)元、基底前腦膽堿能神經(jīng)元的存活、分化及功能表達(dá)，對神經(jīng)元損傷修復(fù)與再生起重要作用［1］。在脊髓運(yùn)動神經(jīng)元中也有一定的分布，并在神經(jīng)損傷后保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元存活及在運(yùn)動神經(jīng)元纖維的再生中發(fā)揮作用。有研究證實BDNF 刺激BMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞分化，而用BDNF 等生長因子誘導(dǎo)的效率較低，同時伴隨神經(jīng)元樣細(xì)胞有很多神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生缺陷［2］。本團(tuán)隊在以往的實驗中已證實 BDNF 在誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的過程中效果顯著，且表現(xiàn)出誘導(dǎo)率低的缺點。

目前很多研究已經(jīng)證實二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等抗氧化劑具有誘導(dǎo)效率高，誘導(dǎo)中少有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的優(yōu)點［3］，但經(jīng)其處理的細(xì)胞存活時間短（約5 h）。而復(fù)合培養(yǎng)基可集中多種誘導(dǎo)劑的優(yōu)點，減少不利因素的干擾。

隨著神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)證實microRNA（miRNA）在整個神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，不僅在胚胎期能夠調(diào)控神經(jīng)元產(chǎn)生/膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生/神經(jīng)元的遷移等生理過程，還能在成年體內(nèi)控制神經(jīng)元受損后的再生，在神經(jīng)功能喪失和恢復(fù)過程中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用［4-8］。miRNA-26a 是眾多miRNA中的一種，脊椎動物特異性的miRNA，最早在小鼠妊娠12 d 開始顯著增加。在平滑肌分化和神經(jīng)元產(chǎn)生過程中miRNA-26a 的含量明顯上調(diào)［9］。

鑒于以上基礎(chǔ)，本實驗研究BDNF 聯(lián)合 DMSO誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的效果，并初步研究miRNA-26a 在神經(jīng)分化中的調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

健康SD 大鼠 4只，4周齡，體質(zhì)量（90±20）g，由河北北方學(xué)院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑

DMEM，購自GIBCO 公司；BDNF，購自GenScript公司；RNA 提取試劑盒，購自TaKaRa 公司；兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

安全工作柜，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，流式細(xì)胞儀，Eclipse 90i倒置熒光顯微鏡，低溫離心機(jī)，凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSCs 的獲取及純度檢測

無菌條件下，從大鼠股骨骨髓腔中獲取BMSCs，培養(yǎng)于含 1%雙抗（青霉素、鏈霉素）+10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM 培養(yǎng)液中。待細(xì)胞密度達(dá)80%時，利用0.25%的胰酶消化進(jìn)行傳代。細(xì)胞培養(yǎng)中，使用倒置顯微鏡觀察生長情況。傳代至第3 代，利用流式細(xì)胞儀檢測 BMSCs 表面標(biāo)志物：CD29，CD34，CD45，CD90，以評價其純度。

1.2.2 BDNF/DMSO 聯(lián)合誘導(dǎo)BMSCs 的分化

將傳至第3 代的BMSCs，以4×105個細(xì)胞每mL密度制備細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁生長，將細(xì)胞分為四組：BDNF 聯(lián)合DMSO組、BDNF組、DMSO組和無處理組。BDNF 聯(lián)合DMSO組加入3% DMSO、DMEM/F12預(yù)誘導(dǎo)液預(yù)誘導(dǎo)2 h，更換誘導(dǎo)液：100 ng·mL-1BDNF、DMEM/F12，誘導(dǎo) 48 h。BDNF組加入含有100 ng·mL-1BDNF 的DMEM/F12 培養(yǎng)液，培養(yǎng)50 h 后備用。DMSO組加入含有3% DMSO 的DMEM/F12 培養(yǎng)液。無處理組只加入DMEM/F12 培養(yǎng)液，培養(yǎng)50 h 后備用。

1.2.3 BMSCs 神經(jīng)分化的鑒定

1.2.3.1 形態(tài)鑒定 采用倒置顯微鏡（Eclipse 90i，Nikon）觀察各組的細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.3.2 免疫組化檢測各組神經(jīng)元特異性烯醇酶（neuron specific enolase，NSE）蛋白的表達(dá) 待 BMSCs細(xì)胞爬片生長至60%左右時，分四組分別進(jìn)行處理：①BDNF 聯(lián) 合DMSO組：加 入3% DMSO、DMEM/F12 預(yù)誘導(dǎo)液預(yù)誘導(dǎo)2 h，更換誘導(dǎo)液：100 ng·mL-1BDNF、DMEM/F12，誘導(dǎo)48 h。②BDNF組：加入含有100 ng·mL-1BDNF 的DMEM/F12 培養(yǎng)液，培養(yǎng)50 h后備用。③DMSO組：加入含有3% DMSO 的DMEM/F12 培養(yǎng)液，處理5 h 后備用。④無處理組：只加入DMEM/F12 培養(yǎng)液，培養(yǎng)50 h 后備用。后續(xù)取出細(xì)胞爬片，進(jìn)行免疫組化的檢測：PBS 洗1次，冷丙酮固定10 min，PBS 洗3次，每次3 min；將蓋玻片浸入3%H2O2中，室溫孵育20 min，PBS 洗3次，每次3 min；用試劑A（正常山羊血清）封閉20 min，吸棄，不予漂洗；分別滴加稀釋后的NSE 抗體（1∶200 稀釋度）置入濕盒中4℃過夜，PBS 漂洗3次，每次3 min；加入試劑B（生物素標(biāo)記的二抗），37℃ 孵育15～20 min，PBS 漂洗3次，每次3 min；滴入試劑C，室溫或37℃孵育15～20 min，PBS漂洗3次，每次3 min；DAB 溶液顯色10 min，自來水沖洗終止反應(yīng)，中性樹膠封片。

1.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測 miRNA-26a、PTEN、mTOR 的表達(dá)變化

選擇BDNF 聯(lián)合DMSO組和無處理組分別誘導(dǎo)16 h、32 h 和48 h 的樣品，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計各基因引物，利用實時熒光定量PCR 檢測PTEN、mTOR 和miRNA-26a 的表達(dá)量（每個基因重復(fù)三次），比較神經(jīng)分化前后的變化。以上各基因引物見Tab.1。

2 結(jié)果

2.1 誘導(dǎo)前后大鼠 BMSCs 細(xì)胞的形態(tài)變化

傳至3 代的細(xì)胞密度均勻，以長梭形為主，流式細(xì)胞儀檢測顯示標(biāo)記物CD29 和CD90 陽性率分別高達(dá)99.8%，88.6%；CD34，CD45陽性率分別為1.8%，23.3%，符合BMSCs 的指標(biāo)特征。各組誘導(dǎo)后，密切關(guān)注其形態(tài)學(xué)變化。BDNF組誘導(dǎo)2 h 后細(xì)胞形態(tài)基本無變化，誘導(dǎo)50 h 后出現(xiàn)少量神經(jīng)樣細(xì)胞；DMSO組誘導(dǎo)2 h 后出現(xiàn)大量神經(jīng)樣細(xì)胞，但誘導(dǎo)50 h 后細(xì)胞大量死亡；無處理組不加任何誘導(dǎo)劑，細(xì)胞形態(tài)沒發(fā)生變化；BDNF 聯(lián)合DMSO組DMSO 預(yù)誘導(dǎo)后，加BDNF誘導(dǎo)2 h 后出現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞，細(xì)胞突起明顯，誘導(dǎo)50 h后神經(jīng)樣細(xì)胞量明顯增多，部分細(xì)胞間形成網(wǎng)絡(luò)樣連接（Fig.1）。

2.2 免疫細(xì)胞組化對BMSCs 分化的鑒定

免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定結(jié)果顯示，已分化的BMSCs 中NSE 呈陽性表達(dá)（Fig.2）。

2.3 實時熒光定量PCR 對誘導(dǎo)前后miRNA-26a、PTEN、mTOR 表達(dá)量的檢測

實時熒光定量PCR 鑒定結(jié)果顯示，與未處理組比較，誘導(dǎo)不同時間后，miRNA-26a 表達(dá)量和mTOR 基因的表達(dá)量升高、而PTEN 表達(dá)量降低，且差異具有顯著性（P＜0.05）（Fig.3）。

3 討論

目前國內(nèi)外對BMSCs 分化和神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的研究主要集中在BMSCs 體外誘導(dǎo)和體內(nèi)移植實驗和研究，關(guān)于BMSCs 向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化已取得了不少成果。2000 年由 Sanchez-Ramos［10］和 Woodbury［3］開始嘗試體外誘導(dǎo) BMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞分化。β-巰基乙醇、DMSO 和丁基羥基茴香醚聯(lián)合，或表皮生長因子EGF、維甲酸和 BDNF 聯(lián)合誘導(dǎo)，均成功讓 BMSCs 分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。隨后國內(nèi)外學(xué)者為尋找誘導(dǎo)BMSCs 分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的方法開展了大量的研究，包括細(xì)胞因子、生長因子等的研究。

細(xì)胞增殖和分化受各種細(xì)胞因子的影響，其中以神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用尤為關(guān)鍵。神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)損傷中調(diào)節(jié)神經(jīng)元活性和修復(fù)。BDNF 是一種重要的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，與其受體酷氨酸激酶受體B 結(jié)合后啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，產(chǎn)生相應(yīng)分子對神經(jīng)元起保護(hù)、促進(jìn)再生作用［11］。同對照組比較，在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基內(nèi)添加BDNF 誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)分化，分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說明BDNF 可誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)細(xì)胞分化［2］，但分化效率較低。

Tab.1 Primer of each gene

Fig.1 Morphological change of BMSCs after being induced（×100）

Fig.2 The expression of NSE protein after being induced（×100）

研究證實DMSO 或BDNF 對 BMSCs 誘導(dǎo)生成神經(jīng)元樣細(xì)胞有一定的促進(jìn)作用，但存在一定的局限性，如誘導(dǎo)效率低、誘導(dǎo)劑對細(xì)胞存在毒性等。因此，本團(tuán)隊首次開展了BDNF 聯(lián)合DMSO 誘導(dǎo)BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化的研究，得到了在形態(tài)和神經(jīng)元標(biāo)志物都呈陽性的神經(jīng)元樣細(xì)胞。

Fig.3 Detection of miRNA-26a，PTEN and mTOR gene expression by Real-time-PCR

體外細(xì)胞水平研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-26a 通過PTEN在神經(jīng)元細(xì)胞突起的生長中發(fā)揮重要作用［12］，本項目組前期研究也表明在神經(jīng)軸突再生中 miRNA-26a介導(dǎo)PTEN 起負(fù)調(diào)控作用，與前人研究結(jié)果相似［13］。PTEN 是1997 年被發(fā)現(xiàn)的一種新型腫瘤抑制基因，主要調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移、分化和凋亡，并參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展［14］。研究發(fā)現(xiàn)利用shRNA 沉默PTEN 基因后可促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和軸突再生［15］。抑制PTEN 基因后，mTOR 信號被激活，受損的神經(jīng)軸突出現(xiàn)再生，并形成突觸連接［16］。綜上所述，miRNA-26a 和PTEN 的變化與神經(jīng)軸突的再生能力有著非常緊密的聯(lián)系，miRNA-26a 通過抑制PTEN 而激活mTOR 信號促進(jìn)軸突再生。以上研究均顯示在神經(jīng)元細(xì)胞中PTEN 是miRNA-26a的一個關(guān)鍵性作用靶點。鑒于miRNA-26a 在神經(jīng)元細(xì)胞突起生長中的重要作用，本研究檢測了其及下游信號分子在 BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化中表達(dá)量的變化，結(jié)果顯示，在BMSCs 向神經(jīng)樣細(xì)胞分化過程中，隨著誘導(dǎo)時間的延長，PTEN 表達(dá)量下降，miRNA-26a和mTOR 表達(dá)量升高。說明miRNA-26a 可能通過PTEN/mTOR 信號通路調(diào)節(jié)神經(jīng)分化。

細(xì)胞水平，神經(jīng)元細(xì)胞分化中PTEN、miRNA-26a 和 mTOR 三者之間的調(diào)控關(guān)系已進(jìn)行了研究，得出了一定的結(jié)論，但在體內(nèi)神經(jīng)損傷或再生過程中三者之間表達(dá)的相關(guān)性還未闡明。因此后續(xù)將首先在動物模型中探討miRNA-26a 和PTEN/mTOR 之間的調(diào)節(jié)作用，為臨床治療神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性疾病提供參考。