魏珍珍 方曉艷 白 明 苗明三 樊帥珂

河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州，450046，中國

缺氧（hypoxia）指因氧氣供應(yīng)不足或用氧障礙，而導(dǎo)致組織的代謝、功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化的病理過程。在臨床各種疾病中極為常見，高強(qiáng)度的腦力勞動(dòng)和體力勞動(dòng)在很多情況下同樣會產(chǎn)生缺氧現(xiàn)象。急性嚴(yán)重的缺氧，器官常出現(xiàn)代償不全和功能障礙，甚至引起重要器官產(chǎn)生不可逆損傷，如腦、心臟等器官缺氧是導(dǎo)致機(jī)體死亡的重要原因。高原環(huán)境下影響人體的主要因素是缺氧，急性高原病是危害急進(jìn)高原人群健康的常見疾病，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為高原腦水腫，危及生命［1］。近年來多項(xiàng)研究表明，許多傳統(tǒng)中藥材具有抗疲勞、提高機(jī)體耐受力和耐缺氧能力的作用，如紅景天［2］、冬蟲夏草［3］、黨參、黃芪、茯苓［4-5］、靈芝［6］等。

芳香療法是指利用有芳香氣味的藥物（如麝香、薄荷、丁香等），以各種形式作用于人體，以達(dá)到防病治病的目的［7-8］。芳香療法在歷代中醫(yī)古籍中有眾多散在記載，可追溯至殷商時(shí)期，在古代西方國家也十分受歡迎。古籍所記載的芳香藥物大多含有精油成分，芳香走竄性強(qiáng)，功效多樣，可以適應(yīng)疾病治療的需求。現(xiàn)代研究表明芳香療法干預(yù)可有效治療多種疾?。?-10］，相關(guān)研究也證明芳香類中藥可以通過嗅覺通路達(dá)到改善學(xué)習(xí)、記憶等認(rèn)知功能的目的［11］。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中藥的藥性、藥效及中醫(yī)基礎(chǔ)理論結(jié)合現(xiàn)代研究選用蘇艾冰精油進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，從中藥中提取精油成分，進(jìn)行配伍組方，探討蘇艾冰精油局部外涂對小鼠耐缺氧能力的影響，為中藥配方精油的應(yīng)用及耐缺氧藥物的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，雌雄各半，SPF 級，體質(zhì)量（20±2）g，合格證號：37009200014824，許可證號：SCXK（魯）20140007，實(shí)驗(yàn)單位使用許可編號：SYXK（豫）2015-0005，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

蘇合香、川芎、當(dāng)歸、薄荷、艾葉、冰片，購自河南張仲景大藥房股份有限公司；蘇艾冰精油（含蘇合香精油6 mL，川芎精油5 mL，當(dāng)歸精油5 mL，薄荷精油5 mL，艾葉精油5 mL，冰片6 g），由河南中醫(yī)藥大學(xué)制劑室提供，批號201 810810；鹽酸異丙腎上腺素，批號720B021，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精油的提?。?2-15］

蘇合香精油、艾葉精油采用水蒸氣蒸餾法提取，提取工藝流程及操作要點(diǎn)：藥材→粉碎→過篩→微波預(yù)處理→水蒸氣蒸餾→萃取→真空濃縮→精油。水蒸氣蒸餾時(shí)，以冷凝管流出第一滴液體時(shí)開始計(jì)時(shí)，蒸餾2 h。蒸餾完畢，收集蒸餾液，用正己烷1∶1 萃取，萃取三次，將萃取液真空濃縮得精油。

川芎精油、當(dāng)歸精油采用超臨界CO2萃取法提取，將干燥樣品粉碎成粗粉，投入萃取釜中，萃取時(shí)間3 h。超臨界萃取流程為：CO2鋼瓶加壓液化系統(tǒng)萃取釜解析釜，液化CO2的流速為100 kg·h-1。

薄荷精油采用微波輔助超臨界CO2萃取法提取，將薄荷的花和葉干燥、粉碎，過40 目篩。取50 g 椒樣薄荷粉，加入1 L 蒸餾水，經(jīng)480 W 微波處理。將微波處理后的樣品置于萃取釜中，用CO2氣體反復(fù)沖洗，排盡空氣，開始萃取，粗油經(jīng)脫水、精制，得到成品。

1.2.2 對小鼠常壓耐缺氧的影響［16］

取昆明種小鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白對照組、蘇艾冰精油高、低劑量組，每組10只。將小鼠頭面部和胸前區(qū)涂抹精油的部位進(jìn)行脫毛處理后，給予頭面部、胸前區(qū)涂抹蘇艾冰精油，高劑量組給藥兩次，間隔30 min，低劑量組給藥一次（每次給藥劑量0.05 mL·cm-2），空白組涂同量蒸餾水。末次給藥10 min后，將小鼠置于250 mL 廣口瓶內(nèi)（瓶內(nèi)盛放15 g 干燥鈉石灰），凡士林密封瓶口，觀察并記錄小鼠在瓶內(nèi)從密閉到呼吸停止的時(shí)間（存活時(shí)間，min）。

1.2.3 對小鼠減壓耐缺氧的影響

給藥方法及分組同1.2.2。真空抽濾瓶頂部放橡膠塞，其橡膠塞打2個(gè)孔，瓶內(nèi)放鈉石灰，一孔連接真空表，另一孔由橡膠管連接緩沖瓶，緩沖瓶連接真空泵，兩瓶之間由管夾控制空氣進(jìn)出量，抽氣使真空表指針達(dá)到0.03～0.035 MPa 之間且平衡為標(biāo)準(zhǔn)，以此模擬高原的低壓環(huán)境。用藥方法同上，于末次給藥10 min 后，將小鼠置于真空抽濾瓶內(nèi)（瓶內(nèi)盛放15 g 干燥鈉石灰），凡士林密封瓶口，觀察并記錄小鼠在瓶內(nèi)從密閉到呼吸停止的時(shí)間（存活時(shí)間，min）。

1.2.4 對異丙腎上腺素致小鼠缺氧的影響［16］

取昆明種小鼠40只，雌雄各半，按體重隨機(jī)分為4組，即空白對照組、異丙腎上腺素模型組、蘇艾冰精油大、小劑量組，每組10只。外涂用藥同上，末次給藥10 min 后，除空白組外，其余各組小鼠均腹腔注射異丙腎上腺素注射液15 mg·kg-1，注射后15 min，小鼠放入裝有15 g 干燥鈉石灰的250 mL 密封廣口瓶中，記錄小鼠存活時(shí)間（min，以呼吸停止為標(biāo)準(zhǔn)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS17.0 醫(yī)用統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行數(shù)據(jù)資料的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有顯著性，證明該數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠常壓耐缺氧的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Tab.1）顯示：與空白對照組相比，蘇艾冰精油高、低劑量組可顯著延長小鼠在常壓密閉缺氧環(huán)境下的存活時(shí)間（P＜0.01），以高劑量組效果較優(yōu)。

Tab.1 Effect of formula essential oil on survival time of atmospheric sealed hypoxic mice

2.2 對小鼠減壓耐缺氧的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Tab.2）顯示：與空白對照組相比，蘇艾冰精油高、低劑量組可顯著延長小鼠在減壓密閉缺氧環(huán)境下的存活時(shí)間（P＜0.01），以高劑量組效果較優(yōu)。

Tab.2 Effect of formula essential oil on survival time of hypobaric sealed hypoxic mice

2.3 對異丙腎上腺素致小鼠缺氧的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Tab.3）顯示：與空白對照組相比，異丙腎上腺素模型組小鼠存活時(shí)間顯著降低（P＜0.01）；與異丙腎上腺素模型組相比，蘇艾冰精油高、低劑量組均可顯著增加小鼠存活時(shí)間（P＜0.01），高劑量組效果較優(yōu)。

Tab.3 Effect of formula essential oil on survival time of hypoxia mice induced by isoproterenol

3 討論

常壓密閉缺氧模型和急性減壓缺氧模型是評價(jià)藥物抗缺氧活性的兩種常用的實(shí)驗(yàn)方法，異丙腎上腺素能夠拮抗腎上腺素功能，加快心率，增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心肌耗氧量，加快氧氣消耗速度，降低缺氧條件下利用氧的能力，縮短其存活時(shí)間［15-16］。急性高空缺氧的損傷與減壓低氧類似，對研發(fā)預(yù)防和治療高原缺氧藥物具有重要意義。

從中藥中提取的精油氣味芳香，具有行氣活血、化濕和中、開竅醒神等功效，揮發(fā)類芳香中藥在煎煮過程中，不可避免地會散失香氣，影響療效，而精油可彌補(bǔ)這一缺陷。精油中的芳香分子通過皮膚吸收進(jìn)入經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)后，藥之氣味隨氣入血，又由經(jīng)穴傳達(dá)于內(nèi)臟，由血脈運(yùn)行而布散于全身，從而糾正五臟六腑的病理狀態(tài)［17］?，F(xiàn)代研究表明，芳香物質(zhì)經(jīng)嗅覺通路的給藥方式，可以達(dá)到有效的神經(jīng)保護(hù)和改善情緒的作用［18-19］。蘇艾冰精油由蘇合香精油、艾葉精油、川芎精油、當(dāng)歸精油、薄荷精油、冰片組成，其中蘇合香屬于芳香類中藥，具有開竅醒腦的功效，對腦缺血損傷大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用［20］；川芎活血行氣，是“血中氣藥”、化瘀良藥，川芎生物堿中的川芎嗪能擴(kuò)張血管、降低心臟前后負(fù)荷、減少心肌耗氧，對異丙腎上腺素致心肌缺血大鼠具有保護(hù)作用［21-22］；當(dāng)歸長于補(bǔ)血，為補(bǔ)血之圣藥，當(dāng)歸揮發(fā)油可以改善細(xì)胞膜的通透性，提高細(xì)胞抗缺氧能力［23］，現(xiàn)代藥理研究表明當(dāng)歸與川芎均具有活血化瘀，改善心腦血管功能的作用，二者揮發(fā)油在缺氧模型下，可通過改善小鼠能量代謝和中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能，保護(hù)缺氧組織，維持小鼠正常的能量活動(dòng)［24］；薄荷屬于芳香辛散藥，艾葉芳香溫散，冰片具有“芳香走竄之性”，能改變血腦屏障的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)藥物透過血腦屏障［25-27］。將芳香療法、精油與中醫(yī)臟腑、經(jīng)絡(luò)、腧穴理論結(jié)合起來，配合中醫(yī)特色外治手法可能會產(chǎn)生更好的療效。

本實(shí)驗(yàn)將蘇艾冰精油局部外用涂抹給藥，探究蘇艾冰精油對缺氧小鼠的影響，結(jié)果表明，蘇艾冰精油可顯著延長常壓密閉缺氧、減壓缺氧、異丙腎上腺素缺氧小鼠的活存時(shí)間，顯著提高小鼠耐缺氧能力。

本實(shí)驗(yàn)不僅為精油配方的外用功能提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)將蘇艾冰精油、芳香療法、嗅覺通路結(jié)合起來，為高原反應(yīng)的防治提供了一種簡易有效的方法，提高機(jī)體在高原的抗缺氧能力，并為耐缺氧藥物的研發(fā)提供了新思路。