史 鑫,王宏杰,王鴻磊,丁 強(qiáng),王紅艷
(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙臺研究院,山東 煙臺 264670)
大禿馬勃(Calvatiagigantea)又名馬糞包,大馬勃,屬真菌界擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌科禿馬勃屬真菌[1-3]。子實(shí)體近球形至球形,直徑15~36 cm或更大,不孕基部無或很小,常單生或群生于草地上,我國東北、華東及西南等地均有分布[4-6]。大禿馬勃子實(shí)體幼時白色,可以食用,味道鮮美,其蛋白質(zhì)含量高達(dá)31.27%,遠(yuǎn)高于香菇、金針菇和平菇等食用菌,且含有豐富的礦物質(zhì),是一種珍稀的食用真菌[7-8]。大禿馬勃也是一種重要的藥用真菌,具有清熱解毒、抗炎止血及抗癌抗腫瘤等功效[9-14],其藥用價值在《本草綱目》中有記載,在《中國藥典》(2005 版)中被列為3種正品馬勃之一[15]。
大禿馬勃是一種極具開發(fā)潛力的食藥用真菌,但目前仍然靠人工采摘野生資源為主,遠(yuǎn)不能滿足其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的需要,發(fā)展大禿馬勃人工栽培勢在必行。目前,大禿馬勃的研究主要集中在抗腫瘤[16]、抗氧化[17]等生藥學(xué)方面和菌絲液體發(fā)酵[18]方面,對人工栽培的研究也僅限于仿野生栽培[19],其生產(chǎn)周期長,產(chǎn)量低,尚沒有工廠化栽培的記錄。筆者所在課題組自野外采集到野生大禿馬勃1株,計劃對其生物學(xué)性質(zhì)、種子制備、栽培方法等進(jìn)行系統(tǒng)研究,以實(shí)現(xiàn)大禿馬勃的工廠化栽培。前期研究發(fā)現(xiàn),大禿馬勃菌絲在普通PDA培養(yǎng)基上生長緩慢,其生長速度為1.179 4 mm/d,導(dǎo)致人工培養(yǎng)周期過長(>20 d)。鑒于此,利用響應(yīng)面法對大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化,旨在為縮短大禿馬勃菌種培養(yǎng)時間,提高其菌絲生長速率并實(shí)現(xiàn)工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。
1.1.1 大禿馬勃菌種 分離保藏于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院微生物研究室。
1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯20 g,葡萄糖20 g,水1 000 mL)和基礎(chǔ)培養(yǎng)基(土豆浸粉6 g,KH2PO42.0 g,MgSO40.5 g,瓊脂20 g,水1 000 mL),自制。
1.2.1 菌種活化 將大禿馬勃菌種接種于PDA培養(yǎng)基平板上,在24℃恒溫避光培養(yǎng)20 d,用Φ5 mm打孔器打取菌絲塊備用。
1.2.2 不同因素對大禿馬勃菌絲生長的影響
1) 最佳碳源。試驗(yàn)設(shè)4個處理,即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加20 g/L的葡萄糖、蔗糖、紅糖和可溶性淀粉。將大禿馬勃菌絲塊接種于碳源篩選培養(yǎng)基平板上,每個處理接種1塊,6次重復(fù),24℃培養(yǎng),從第9天開始,每2 d測量1次菌落直徑,計算菌絲生長量。以菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的碳源為最佳碳源。
菌絲生長量=(菌落直徑-菌絲塊直徑)/2
2) 最佳氮源。試驗(yàn)設(shè)7個處理,在最佳碳源培養(yǎng)基中分別添加5 g/L的蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、豆餅粉及黃豆粉。將大禿馬勃菌絲塊接種于氮源篩選培養(yǎng)基平板上,每個處理接種1塊,6次重復(fù),24℃培養(yǎng),從第8天開始,每2 d測量1次菌落直徑,計算菌絲生長量。以菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的氮源為最佳氮源。
3) 淀粉濃度。試驗(yàn)設(shè)5個處理,即在5 g/L豆餅粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養(yǎng)基中分別添加10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L及30 g/L淀粉。每個處理接種1塊,6次重復(fù),24℃培養(yǎng),觀察菌絲生長情況,當(dāng)有1個平板的菌絲長到接近9 cm培養(yǎng)皿邊緣時試驗(yàn)結(jié)束(下同),開始測量菌絲生長量,記錄培養(yǎng)時間,確定最佳淀粉濃度。
4) 豆餅粉濃度。試驗(yàn)設(shè)5個處理,即在15 g/L淀粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養(yǎng)基中分別添加1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L和9 g/L豆餅粉。每個處理接種1塊,6次重復(fù),24℃培養(yǎng),觀察菌絲生長情況,記錄培養(yǎng)時間,確定最佳豆餅粉濃度。
5)土豆浸粉濃度。試驗(yàn)設(shè)5個處理,即在15 g/L淀粉+7 g/L豆餅粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養(yǎng)基中分別添加2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L土豆浸粉。每個處理接種1塊,6次重復(fù),24℃培養(yǎng),觀察菌絲生長情況,記錄培養(yǎng)時間,確定最佳土豆浸粉濃度。
1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基配方 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定影響大禿馬勃菌絲生長的試驗(yàn)因素,選擇豆餅粉(A)、淀粉(B)和土豆浸粉(C)3個因素為自變量,以菌絲生長量為響應(yīng)值(Y),采用3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面分析法篩選大禿馬勃培養(yǎng)基最優(yōu)配方;通過試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸和方差分析,根據(jù)模型方程繪制大禿馬勃菌絲生長響應(yīng)面曲面圖及等高線,并根據(jù)響應(yīng)面曲線的陡峭程度及效應(yīng)面的等高線形狀確定最優(yōu)配方組合。
利用SPSS 13.0和Origin 7.5進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪圖,利用Design-Expert 7.1.3進(jìn)行響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計與分析。
從圖1可見,不同碳源、氮源和不同濃度的淀粉、土豆浸粉和豆餅粉對大禿馬勃菌絲的生長有不同程度的影響。
2.1.1 碳源 大禿馬勃菌絲在以淀粉和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上生長速度較快,培養(yǎng)至第17天時部分平板的菌絲已接近培養(yǎng)皿邊緣,二者平均菌絲生長量相當(dāng),分別為2.931 cm和2.795 cm,但以淀粉為碳源培養(yǎng)的大禿馬勃菌絲密度更大,所以選擇淀粉為培養(yǎng)大禿馬勃菌絲的最佳碳源。
2.1.2 氮源 大禿馬勃菌絲在以豆餅粉和黃豆粉為氮源的培養(yǎng)基上生長速度較快,培養(yǎng)至第18天時,以豆餅粉為氮源培養(yǎng)的大禿馬勃菌絲生長量和菌絲密度均最大,其生長量為2.703 cm,所以選擇豆餅粉為培養(yǎng)大禿馬勃菌絲的最佳氮源。
2.1.3 淀粉 隨著淀粉濃度增大,大禿馬勃菌絲生長量呈先升后降趨勢。其中,當(dāng)?shù)矸蹪舛葹?5 g/L時菌絲生長量達(dá)最大,為3.371 cm;繼續(xù)增大淀粉濃度則菌絲生長量反而下降。因此,最佳淀粉濃度以15 g/L為宜。
2.1.4 土豆浸粉 土豆浸粉對大禿馬勃菌絲生長的影響趨勢與淀粉的基本相同,也呈先升后降趨勢。即隨著土豆浸粉濃度增大大禿馬勃菌絲的生長量呈上升趨勢,當(dāng)濃度為6 g/L時菌絲生長量達(dá)最大,為3.386 cm;濃度繼續(xù)增大則菌絲生長量下降。因此,最佳土豆浸粉濃度以6 g/L為宜。
2.1.5 豆餅粉 豆餅粉對大禿馬勃菌絲生長的影響趨勢與淀粉和土豆浸粉基本相同,亦呈先升后降趨勢。當(dāng)豆餅粉濃度為1~7 g/L時大禿馬勃菌絲的生長量呈上升趨勢,并在濃度為7 g/L時達(dá)最大,為3.803 cm;繼續(xù)增大豆餅粉濃度則菌絲生長量下降。因此,豆餅粉濃度以7 g/L最佳。
圖1 不同因素處理大禿馬勃菌絲的生長量Fig.1 Effect of different factors on mycelia growth of C.gigantean
從表1可見,處理4的菌絲生長量最大,為3.925 cm,其次是處理9和處理5,分別為3.890 cm和3.875 cm;處理1最小,為2.905 cm。對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)式擬合回歸得二項(xiàng)式擬合方程為各處理菌絲生長量(Y)進(jìn)行二次回歸擬合,得方程Y=-0.38+0.34A+0.32B+0.29C+0.05AB+0.02AC+0.002 5BC-0.08A2-0.025B2-0.04C2。其中,模型P=0.002 3(<0.01),擬合不足P=0.163 9(>0.05),R2=0.934 2,說明,通過響應(yīng)面法擬合所得二次回歸模型與實(shí)際值擬合度高,模型回歸達(dá)極顯著,模型與試驗(yàn)各因素相關(guān)度好,試驗(yàn)方法可靠且誤差小,能夠很好地分析和預(yù)測大禿馬勃菌絲的生長量。豆餅粉的二次項(xiàng)(A2)及豆餅粉與淀粉的交互作用(AB)的P值分別為0.000 3和0.006 0,均<0.01,說明,二者對菌絲生長量的影響達(dá)極顯著水平;豆餅粉(A)、淀粉(B)及土豆浸粉二次項(xiàng)(C2)的P值分別為0.013 1、0.034 5和0.015 0,均<0.05,說明,三者對菌絲生長量的影響達(dá)顯著水平;各因素對大禿馬勃菌絲生長量的影響依次為A2>AB>A>C2>B>B2>C>AC>BC。
表1 大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基配方的響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 1 The scheme and results of the response surface experiment for optimizing medium formula in mycelia growth of C.gigantean
從圖2可知,3個響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面,說明,響應(yīng)值存在極高值。響應(yīng)曲面的等高線中心均位于-1~1,說明,菌絲生長的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計的因素水平范圍之內(nèi)。3組交互效應(yīng)的等高線形狀均為橢圓形,表示各因素的交互作用顯著。由此確定大禿馬勃菌絲培養(yǎng)基的最佳配方為2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂+7.10 g/L豆餅粉+14.11 g/L淀粉+6.00 g/L土豆浸粉,在此條件下菌絲生長量預(yù)計最大可達(dá)3.87 cm。根據(jù)最佳配方配制培養(yǎng)基對模型進(jìn)行3次以上驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果表明,菌絲培養(yǎng)時間為11 d時平均菌絲生長量達(dá)3.795 cm,與預(yù)測值相比誤差為1.94%。說明,該試驗(yàn)建立的因素與響應(yīng)值的回歸模型科學(xué)合理,可以較好地預(yù)測大禿馬勃菌絲生長量。優(yōu)化后大禿馬勃菌絲的生長速度為3.45 mm/d,為優(yōu)化前的2.93倍,極大地提高了大禿馬勃的培養(yǎng)效率。
圖2 不同因素下大禿馬勃菌絲生長量的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface and contour line of mycelia growth of C.gigantean under different factors
大禿馬勃是一種珍稀的食藥用真菌,具有廣闊的食品和醫(yī)藥開發(fā)價值[20-21]。由于野生資源有限,人工栽培是大禿馬勃開發(fā)的必由之路。研究結(jié)果表明,大禿馬勃菌絲培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為豆餅粉7.10 g/L、淀粉14.11 g/L、土豆浸粉6.00 g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO40.5 g/L及瓊脂20 g/L。此條件下菌絲生長速度達(dá)3.45 mm/d,培養(yǎng)時間縮短至11 d,平均菌絲生長量達(dá)3.795 cm。