許志美，馬雁，印伯星，魯茂林，桑建，黃玉軍，關(guān)成冉，顧瑞霞，*

（1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州225127；2.江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇揚(yáng)州225127）

蘆筍屬于百合科天門冬屬多年生草本植物，含有多種營(yíng)養(yǎng)元素、人體必須氨基酸和礦物質(zhì)，同時(shí)富含黃酮類等多種生物活性成分，具有抗腫瘤、抗突變、抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)等生物功能[1]，在當(dāng)今社會(huì)越來越受到人們的關(guān)注和喜愛。但蘆筍作為一種季節(jié)性蔬菜，種植范圍非常受季節(jié)和地域的限制，不易在冬季和部分地區(qū)被人購買食用，并且，蘆筍儲(chǔ)存時(shí)間一旦過長(zhǎng)，不僅營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量流失，還會(huì)產(chǎn)生亞硝酸鹽等有毒有害物質(zhì)。

近年來，關(guān)于蘆筍深加工研究的報(bào)道眾多，如蘆筍茶、蘆筍酸奶、蘆筍飲料和蘆筍酒等方便食品[2-5]，利用蘆筍提取物開發(fā)的蘆筍口服液、蘆筍沖劑、蘆筍膠囊等保健品陸續(xù)上市[6]，然而，關(guān)于蘆筍發(fā)酵蔬菜類產(chǎn)品的報(bào)道卻很少。乳酸菌是一群能發(fā)酵碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的益生菌，乳酸菌發(fā)酵蔬菜是降低亞硝酸鹽、提高安全性以及增加營(yíng)養(yǎng)成分的一種有效方法[7]。

本文采用不同乳酸菌及其組合發(fā)酵綠蘆筍，以自然發(fā)酵為對(duì)照，通過比較蘆筍發(fā)酵過程中各成分的動(dòng)態(tài)變化，選擇適用蘆筍發(fā)酵的最佳乳酸菌及最佳發(fā)酵時(shí)間，為發(fā)酵蘆筍產(chǎn)品制作提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠蘆筍：市售；發(fā)酵乳桿菌Xd（Lactobacillus fermentum Xd）、植物乳桿菌5-7-3（Lactobacillus plantarum 5-7-3）：從傳統(tǒng)酸菜中分離獲得，由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫保藏；德氏乳桿菌保加利亞亞種Y430（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus Y430）、副干酪乳桿菌 Yd（Lactobacillus paracasei Yd）：從乳制品中分離獲得，由江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種庫保藏；乙醇、草酸、2，6-二氯靛酚、亞鐵氰化鉀、冰醋酸、乙酸鋅、四水硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸、鹽酸乙二胺、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁：均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸標(biāo)品、蘆丁標(biāo)品：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；MRS液體培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JF-SX-500全自動(dòng)滅菌鍋：日本TOMY公司；ZHJH-C1209B超凈工作臺(tái)：上海智城分析儀器制造有限公司；FIS#13-636 XL25型 pH 計(jì)：Fisher Scientific；Millipore Direct8超純水儀：美國Millipore公司；SPX-150BS-1I生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Bio-Tck ELX800酶標(biāo)儀：美國寶特公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

在無菌條件下，將凍干保存的4株乳酸菌Xd、5-7-3、Y430、Yd按5%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，混勻后置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，作為1代菌，同樣操作重復(fù)兩次，活化至3代菌，待用。

1.3.2 蘆筍發(fā)酵工藝流程

參考蓮藕發(fā)酵方法并適當(dāng)調(diào)整[8]。

新鮮綠蘆筍→切除根部→清洗→切段（5 cm～6 cm長(zhǎng)）→95℃熱水中漂燙處理3 min→瀝干→添加配料（20 g/kg鹽和40 g/kg糖）→接菌（5 g/100 g乳酸菌菌液）→密封置于30℃暗處發(fā)酵→于蘆筍發(fā)酵的第0、2、4、6、8、10、12 天各取 100 g蘆筍樣品，以用于營(yíng)養(yǎng)功能指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 pH值的測(cè)定

蘆筍樣品與去離子水1∶1（g/mL）混合制成蘆筍勻漿，稱取10.00 g蘆筍勻漿離心，用pH計(jì)直接測(cè)定上清液pH值，即為蘆筍樣品pH值。

1.4.2 總酸的測(cè)定

采用直接滴定法[9]，稱取10.00g蘆筍勻漿，加80 mL去離子水，沸水浴加熱30 min，使有機(jī)酸全部溶出，冷卻后加水定容至250 mL，4 500 r/min離心10 min，得上清液。稱取25 g上清液，加40 mL去離子水，滴加2滴酚酞溶液（0.2 mol/L），用 NaOH 溶液（0.01 mol/L）滴定至溶液變成粉紅色且30 s不褪色，記錄消耗的NaOH溶液體積，計(jì)算出總酸含量。同時(shí)用去離子水代替樣品做空白試驗(yàn)。

1.4.3 抗壞血酸的測(cè)定

采用2，6-二氯靛酚滴定法[10]。稱取10.00 g蘆筍勻漿，用草酸溶液（20 g/L）定容至 100 mL，4 500 r/min離心10 min，得上清液。吸取10 mL上清液，用標(biāo)定過的2，6-二氯靛酚溶液（0.2 mg/mL）滴定至變成粉紅色且30 s不褪色，記錄消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積，計(jì)算出抗壞血酸含量。同時(shí)用去離子水代替樣品做空白試驗(yàn)。

1.4.4 黃酮的測(cè)定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[11]，略作修改。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別吸取 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL），用去離子水補(bǔ)至1 mL，加1 mL 的 NaNO2溶液（0.05 g/mL），混勻后靜置 6 min，加1 mL的Al（NO3）3溶液（0.1 g/mL），混勻后靜置6 min，加3 mL的NaOH溶液（0.04 g/mL），混勻后靜置15 min，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定OD值。以蘆丁含量（mg）為x，510nm處的OD值為y，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：稱取5.00 g蘆筍勻漿，加50 mL 70%乙醇溶液，50℃超聲波輔助提取30 min，4 500 r/min離心10 min，得上清液。取1 mL上清液，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法進(jìn)行操作，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出黃酮含量。同時(shí)用去離子水代替樣品做空白試驗(yàn)。

1.4.5 亞硝酸鹽的測(cè)定

采用鹽酸萘乙二胺法[12]。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：吸取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0 μg/mL），加2 mL對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min，加1 mL鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L），定容至 50 mL，混勻，靜置 15 min，于波長(zhǎng)538 nm處測(cè)OD值，以蘆丁含量（mg）為x，538 nm處的OD值為y，繪制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：稱取5.00 g蘆筍勻漿，加12.5 mL飽和硼砂溶液（50 g/L），攪拌均勻，加300 mL去離子水，沸水浴加熱15 min，冷卻，加5 mL亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L），勻，加5 mL乙酸鋅溶液（220g/L），定容至500 mL，搖勻后放置30 min，4 500 r/min離心10 min，得上清液。吸取40.0 mL上清液，按照亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法測(cè)定，根據(jù)亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出亞硝酸鹽含量。同時(shí)用去離子水代替樣品做空白試驗(yàn)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用Microsoft Excel 2016整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用IBM SPSS Statistics 22統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用OriginPro 2017繪圖。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，不同處理間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法，當(dāng)P＜0.05時(shí)，判定為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中pH值的變化

pH值是判別發(fā)酵程度的重要因素，一般來說，發(fā)酵蔬菜成熟時(shí)的pH值為3.5左右，此時(shí)風(fēng)味最佳[13]。用4株乳酸菌（發(fā)酵乳桿菌Xd、植物乳桿菌5-7-3、德氏乳桿菌保加利亞亞種Y430、副干酪乳桿菌Yd）及其6 種雙菌株組合（Yd+Xd、Yd+Y430、Yd+5-7-3、Xd+Y430、Xd+5-7-3、Y430+5-7-3）在 30 ℃條件下發(fā)酵蘆筍12 d，每2 d測(cè)定發(fā)酵蘆筍的pH值，其pH值變化情況如圖1所示。

圖1 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH value during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖1可知，蘆筍pH值隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。自然發(fā)酵蘆筍的pH值緩慢下降，其pH值從6.55下降至4.24。乳酸菌發(fā)酵蘆筍的pH值快速下降，在發(fā)酵前8 d，pH值快速從6.55下降至3.44，此時(shí)乳酸菌發(fā)酵蘆筍已經(jīng)開始成熟，在發(fā)酵8 d～12 d，pH值趨于穩(wěn)定，其范圍為3.19～3.44。不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍之間的pH值無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中總酸的變化

總酸是判別發(fā)酵程度的另一個(gè)重要因素，發(fā)酵蔬菜的最適總酸范圍為6 g/kg～8 g/kg，此時(shí)口感最佳[13]。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發(fā)酵蘆筍12 d的總酸含量變化情況如圖2所示。

圖2 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中總酸的變化Fig.2 Changes of total acid during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖2可知，發(fā)酵蘆筍的總酸含量在發(fā)酵前期快速上升，而在發(fā)酵后期，其總酸含量趨于穩(wěn)定。自然發(fā)酵蘆筍的總酸含量上升最緩慢，在發(fā)酵12 d期間，從0.84 g/kg增加到4.54 g/kg，酸度不足，發(fā)酵蘆筍不能達(dá)到最佳口感。除了Yd發(fā)酵蘆筍外，乳酸菌發(fā)酵蘆筍的總酸在發(fā)酵8 d～12 d期間趨于穩(wěn)定，其總酸含量處于6 g/kg～8 g/kg，此時(shí)發(fā)酵蘆筍口感最佳。乳酸菌發(fā)酵蘆筍在發(fā)酵8 d時(shí)均已經(jīng)開始成熟。而Yd發(fā)酵蘆筍的總酸含量在發(fā)酵后期仍快速增加，在發(fā)酵10 d時(shí)為8.48 g/kg（＞8 g/kg），口感已經(jīng)不是最佳。

2.3 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中抗壞血酸的變化

抗壞血酸是蘆筍中含量較高的維生素，是一種高效抗氧化劑，其含量影響蘆筍的抗氧化能力。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發(fā)酵蘆筍12 d的抗壞血酸含量變化情況如圖3所示。

圖3 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中抗壞血酸的變化Fig.3 Changes of ascorbic acid during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖3可知，在整個(gè)發(fā)酵期間，發(fā)酵蘆筍中的抗壞血酸含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。其可能是原料中的抗壞血酸滲透到發(fā)酵液中而流失或被氧化而減少[14]，這與白菜發(fā)酵過程的抗壞血酸含量研究[15]和辣椒腌制過程的抗壞血酸含量研究的結(jié)果一致[16]。自然發(fā)酵的抗壞血酸含量下降最快，從18.17 mg/100 g下降至6.03 mg/100 g。乳酸菌發(fā)酵蘆筍的抗壞血酸含量始終高于自然發(fā)酵。Y430發(fā)酵蘆筍的抗壞血酸含量最高，在發(fā)酵12 d時(shí)仍保留11.35 mg/100 g，Yd+Y430發(fā)酵蘆筍的抗壞血酸含量?jī)H低于Y430發(fā)酵組，在所有乳酸菌組合發(fā)酵蘆筍中最高，在發(fā)酵12 d時(shí)，其抗壞血酸含量為10.28 mg/100 g。

2.4 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中黃酮的變化

黃酮是一種功能性很強(qiáng)的抗氧化劑，其含量同樣影響蘆筍的抗氧化能力。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發(fā)酵蘆筍12 d的黃酮含量變化情況如圖4所示。

由圖4可知，自然發(fā)酵蘆筍的黃酮含量在發(fā)酵前8 d一直低于乳酸菌發(fā)酵組，其在發(fā)酵0～2 d下降至7.499 mg/100 g，在發(fā)酵 2 d～8 d 上升至 3.668 mg/100 g，在發(fā)酵8 d～12 d保持穩(wěn)定。乳酸菌發(fā)酵蘆筍的黃酮含量在整個(gè)發(fā)酵期間均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，其在發(fā)酵8 d時(shí)達(dá)到最大值，Y430和Yd+Y430發(fā)酵蘆筍的黃酮含量明顯高于其他發(fā)酵組，分別為63.174 mg/100 g和56.622 mg/100 g。在發(fā)酵前期，可能是乳酸菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生多種酶，促進(jìn)黃酮合成[17]。在發(fā)酵后期，可能是發(fā)酵產(chǎn)酸導(dǎo)致強(qiáng)酸環(huán)境，黃酮在強(qiáng)酸環(huán)境中不穩(wěn)定而被分解[18]。

圖4 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中黃酮的變化Fig.4 Changes of flavonoids during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

2.5 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中亞硝酸鹽的變化

亞硝酸鹽是一種強(qiáng)毒性物質(zhì)，可與仲胺反應(yīng)生成致癌物亞硝胺[8]。在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中，蔬菜及其制品和腌漬蔬菜的亞硝酸鹽限量為20 mg/kg[19]。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發(fā)酵蘆筍12 d的亞硝酸鹽含量變化情況如圖5所示。

圖5 不同乳酸菌及其組合發(fā)酵蘆筍過程中亞硝酸鹽的變化Fig.5 Changes of nitrite during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖5可知，最初蘆筍原料的亞硝酸鹽含量很低，只有1.34 mg/kg，在整個(gè)發(fā)酵期間，發(fā)酵蘆筍的亞硝酸鹽含量呈先上升后下降趨勢(shì)，出現(xiàn)亞硝峰，這可能是植物中存在的硝酸還原酶所致[20-21]。自然發(fā)酵蘆筍在發(fā)酵6 d時(shí)出現(xiàn)亞硝峰，其峰值為46.32 mg/kg，發(fā)酵6 d后，其亞硝酸鹽含量一直維持較高水平，在發(fā)酵12 d時(shí)為39.33 mg/kg。乳酸菌發(fā)酵蘆筍的亞硝酸鹽含量在整個(gè)發(fā)酵期間明顯低于自然發(fā)酵，在發(fā)酵8 d時(shí)，乳酸菌發(fā)酵蘆筍的亞硝酸鹽均低于20 mg/kg，達(dá)到食用安全期。Yd+Y430和Xd+Y430發(fā)酵蘆筍的亞硝峰提前出現(xiàn)在發(fā)酵4 d時(shí)，其亞硝酸鹽峰值分別為21.80 mg/kg和20.20 mg/kg，其食用安全期也提前至發(fā)酵6 d，此時(shí)其亞硝酸鹽含量分別為16.36 mg/kg和17.27 mg/kg（＜20 mg/kg）；Y430和Y430+5-7-3發(fā)酵蘆筍的亞硝酸鹽峰值分別為19.33 mg/kg和10.61 mg/kg（＜20 mg/kg），一直處于在食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的亞硝酸鹽限量?jī)?nèi)，所以Y430和Y430+5-7-3發(fā)酵蘆筍無亞硝酸鹽危害。

3 討論

乳酸菌發(fā)酵蔬菜有利于改善風(fēng)味，抑制雜菌生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品安全性[13]。本文采用4株乳酸菌及其6種雙菌組合發(fā)酵綠蘆筍，從產(chǎn)酸能力來看，4株乳酸菌和6種雙菌組合均具有迅速發(fā)酵能力，使pH值快速降低而總酸含量快速升高，使產(chǎn)品快速達(dá)到風(fēng)味最佳時(shí)要求的外部條件，同時(shí)，后期的酸性環(huán)境也可抑制雜菌的生長(zhǎng)。乳酸菌發(fā)酵蘆筍的pH值和總酸含量在發(fā)酵8 d～12 d期間趨于穩(wěn)定，這可能是乳酸菌在前期快速生長(zhǎng)產(chǎn)生大量乳酸而在后期受到強(qiáng)酸環(huán)境抑制而減少甚至停止產(chǎn)酸[6，23]。

從營(yíng)養(yǎng)與功能成分來看，4株乳酸菌和6種雙菌組合均具有改善營(yíng)養(yǎng)與功能成分能力，乳酸菌發(fā)酵蘆筍中抗壞血酸和黃酮含量均高于自然發(fā)酵蘆筍，有利于增強(qiáng)發(fā)酵蘆筍的抗氧化性。Y430和Yd+Y430發(fā)酵蘆筍的抗壞血酸含量和黃酮峰值含量明顯高于其他乳酸菌及其雙菌組合發(fā)酵。這表明Y430和Yd+Y430對(duì)抗壞血酸的抑制作用和對(duì)黃酮合成的促進(jìn)作用最強(qiáng)。

從安全性來看，4株乳酸菌和6種雙菌組合均具有降解亞硝酸鹽能力，乳酸菌發(fā)酵蘆筍的亞硝酸鹽含量明顯低于自然發(fā)酵，有利于提高發(fā)酵蘆筍的安全性。乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)理主要是酶降解和酸降解兩種[24]。乳酸菌生長(zhǎng)代謝能夠產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶，促使亞硝酸鹽進(jìn)行酶降解[25]。乳酸菌快速產(chǎn)酸，促使亞硝酸鹽進(jìn)行酸降解[26]。另外，與其他菌株發(fā)酵相比，Y430和Yd+Y430發(fā)酵蘆筍中亞硝酸鹽含量也較低，這可能是因其抗壞血酸和高酮含量較高，具有還原性的抗壞血酸和黃酮也能夠降解亞硝酸鹽[27-28]。

4 結(jié)論

本文采用4株乳酸菌及其6種雙菌組合發(fā)酵綠蘆筍，結(jié)果顯示：乳酸菌發(fā)酵蘆筍的產(chǎn)酸能力、降解亞硝酸鹽能力、抗壞血酸和黃酮含量均高于自然發(fā)酵，其中Y430和Yd+Y430分別是蘆筍發(fā)酵的最佳單菌和最佳雙菌組合，蘆筍發(fā)酵的最佳時(shí)間為8 d。為人工接種發(fā)酵蘆筍運(yùn)用到工業(yè)化生產(chǎn)中提供一定的理論依據(jù)。