鄭麗娜，趙大慶，趙文學，喬巨慧，劉穎，劉美辰

（長春中醫(yī)藥大學吉林省人參科學研究院，吉林長春130117）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是發(fā)病率最高的神經退行性疾病，以其在老年人群中的高發(fā)性和對社會的危害性而備受關注[1]。隨著社會人口老齡化的進程，AD有效預防和治療手段的研發(fā)迫在眉睫。AD 的發(fā)病機制復雜，β-淀粉樣蛋白（amyloid β，Aβ）沉積形成的老年斑及神經原纖維纏結形成是AD典型病理特征[2]。研究表明Aβ可直接或間接對線粒體結構及功能造成損傷，進而誘發(fā)氧化應激、激活凋亡信號通路等級聯反應[3]；另一方面可促進Aβ生成，進一步加重線粒體損傷，從而形成惡性循環(huán)，導致神經元變性凋亡。因此，抑制Aβ誘導的線粒體損傷對減輕AD病理損害具有重要意義[4-5]。

天然藥物對疾病的干預具有多靶點、低毒性和整體調節(jié)的作用優(yōu)勢，已被越來越多的研究人員所關注。其中，人參（Panax ginseng C.A.Mey）為“百草之王”，具有“調神益智”的傳統(tǒng)功效，同時現代藥理研究也證明了人參中多種活性成分在AD的預防和治療中具有良好的作用效應[6-10]，但其保護作用機制尚不明確。因此，本研究選擇人參中主要活性成分——人參水溶性總蛋白，以Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞凋亡作為神經元損傷的體外模型，從細胞水平考察人參水溶性總蛋白對神經元的保護作用；進而利用分子生物學相關實驗技術從線粒體功能維系的角度闡明人參總蛋白參與的細胞內調控途徑，為研制更為有效的抗AD藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

人參水溶性總蛋白（ginseng water soluble total protein，GTP）：長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥大健康創(chuàng)新中心提供，批號2018030701，總蛋白質量分數為83.25%；Aβ25-35：Sigma公司；CCK-8 試劑盒：博士德生物有限公司；細胞凋亡檢測試劑盒：BD PharmingenTM；ROS檢測試劑盒：Thermo Fisher Scientific；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD） 活力、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；ATP檢測試劑盒、羅丹明123、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、Beta-Tubulin內參抗體（β-tubulin rabbit monoclonal antibody，β-tubulin）和細胞色素C抗體（cytochrome C rabbit monoclonal antibody，Cyto C）：碧云天生物有限公司；COX IV線粒體內參抗體（Anti-COX IV antibody，COX IV）：愛必信生物科技有限公司，B淋巴細胞瘤-2基因抗體（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關 X蛋白抗體（Bcl-2 associated X protein，Bax）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶抗體（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogensae，GAPDH）：abcam 公司（美國）司；磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）：Hyclone 生物有限公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基：BI公司；胎牛血清：Gibco公司。

1.2 主要儀器

Infinite M200PR0全自動酶標儀：Tecan公司；Flow Sight多維全景流式細胞儀：Amnis公司；Mini Protean蛋白電泳儀（PowerPacTMHC）：Bio-rad公司；371細胞培養(yǎng)箱：Thermo公司。

1.3 細胞培養(yǎng)

人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）：中國科學院上海細胞庫。SH-SY5Y細胞于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 AD細胞模型的建立

配制Aβ25-35母液，濃度為500μmol/L，于37℃孵育7d以形成聚集形式，即為老化的Aβ25-35。用DMEM/F12全培養(yǎng)基將老化的Aβ25-35稀釋至25μmol/L，加入至細胞中培養(yǎng)24h，即獲得AD細胞模型。

1.5 實驗分組

對照組：DMEM/F12完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)；模型組：加入終濃度為25μmol/L老化的Aβ25-35培養(yǎng)SH-SY5Y細胞24 h；藥物干預組：利用不同濃度的人參水溶性總蛋白（6.25、12.5、25μg/mL）預保護 SH-SY5Y 細胞 12 h，隨后加入25μmol/L的Aβ25-35共同孵育24 h。

1.6 CCK-8法檢測細胞活力

SH-SY5Y細胞接種于96孔培養(yǎng)板，按照實驗分組干預處理后每孔加入CCK-8溶液20μL，37℃繼續(xù)孵育1 h，終止培養(yǎng)，設置空白孔調零，酶標儀上震蕩3 min后在450 nm波長處檢測各孔OD值，記錄并計算細胞存活率。

1.7 細胞凋亡檢測

SH-SY5Y細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實驗2分組干預處理后收集細胞，用PBS洗滌細胞3次，1 200 r/min離心5 min，加入 200μL 1×Binding buffer懸浮細胞，之后加入5μL Annexin V-EGFP混勻后，加入5μL Propidium Iodied混勻，室溫避光反應15 min，用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長Ex=488 nm，發(fā)射波長Em=530 nm。Annexin V-EGFP的綠色熒光通過FITC通道檢測，PI紅色熒光通過PI通道檢測。熒光補償調節(jié)使用未經凋亡誘導處理的正常細胞作為對照進行熒光補償調節(jié)去除光譜重疊和設定十字門的位置。

1.8 胞內ROS水平檢測

用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA，終濃度為10μmol/L。細胞培養(yǎng)結束后，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100μL稀釋好的DCFH-DA，在37℃的CO2培養(yǎng)箱內孵育20 min。用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液輕輕洗滌細胞3次，去除未進入細胞內的DCFH-DA，注意不要將細胞吸出。使用流式細胞儀檢測。使用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，檢測藥物作用前后熒光的強弱。

1.9 SOD活力和MDA含量檢測

將各組細胞勻漿后置于冰上裂解，離心收集上清，使用SOD活力檢測試劑盒進行SOD活力檢測，MDA含量檢測試劑盒測定MDA含量。

1.10 ATP含量檢測

SH-SY5Y細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實驗分組干預處理后嚴格按ATP含量測試盒說明書進行操作，利用紫外分光光度計檢測各孔吸光度值，記錄并計算ATP含量。

1.11 線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）分析

SH-SY5Y細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實驗分組干預處理后收集細胞，用PBS洗滌細胞3次，加入羅丹明123使其終濃度為2μmol/L，37℃避光孵育30 min，1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS洗滌細胞3次，最后加入200μL PBS重懸細胞，使用流式細胞儀檢測，激發(fā)波長507nm，最大發(fā)射波長529nm，檢測藥物作用前后熒光強弱。

1.12 蛋白提取和Western blot

SH-SY5Y細胞接種于6孔培養(yǎng)板，按照實驗分組處理后收集細胞，PBS洗滌3次，加入細胞裂解液裂解細胞，使用BCA試劑盒測定蛋白含量，制樣。SDSPAGE 凝膠配制，上樣，70 V 30 min，140 V 50 min電泳后使用NC膜18 V 350 mA半濕法轉膜20 min，5%PBS奶粉封閉30 min，PBST洗滌膜片3次，每次5 min，切膜，4℃一抗孵育過夜（β-Tubulin按1∶1 000稀釋，COX IV及cyt-c按1∶500稀釋），收集一抗，用1%PBS奶粉稀釋二抗，二抗孵育1 h，顯色處理，避光。

1.13 統(tǒng)計學分析

除特殊說明外，所有研究均進行3次生物學重復，數據以means±SD形式展示。統(tǒng)計學分析應用Graph－Pad Prism6軟件完成，組間差異分析應用One-way ANOVA分析方法完成。

2 結果與分析

2.1 人參水溶性總蛋白對Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞的保護作用

GTP對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力和凋亡的影響見圖1。

為了明確GTP對Aβ25-35損傷SH-SY5Y細胞的影響，首先采用CCK-8法檢測GTP作用前后細胞活力的改變，如圖1A所示，不同濃度的GTP可以減緩Aβ誘導所致細胞活力降低，并呈現濃度依賴性。由圖1B和圖1C可知，流式細胞術Annexin V/PI雙染色定量檢測細胞凋亡程度，結果顯示GTP預處理可顯著降低Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡數量，且呈劑量依賴性。

2.2 GTP對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞氧化應激壓力的影響

GTP降低Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激壓力見圖2。

應用DCFH-DA熒光探針檢測Aβ25-35損傷后細胞內ROS生成量。結果可見，Aβ25-35處理可顯著增加SH-SY5Y胞內ROS生成量，給予不同濃度GTP預處理，可降低胞內ROS水平（圖2A）。同時GTP預處理可降低胞內MDA含量，增加SOD活力（圖2B和圖2C）。

2.3 GTP對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞線粒體功能紊亂的挽救

GTP對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞線粒體功能紊亂的挽救見圖3。

圖1 GTP對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力和凋亡的影響Fig.1 Effect of GTP on Aβ25-35induced SH-SY5Y cell viability and apoptosis

圖2 GTP降低Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激壓力Fig.2 GTP reduces the oxidative stress induced by Aβ25-35in SH-SY5Y cells

圖3 GTP對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞線粒體功能紊亂的挽救Fig.3 GTP rescue of mitochondrial dysfunction induced by Aβ25-35in SH-SY5Y cells

線粒體在細胞凋亡過程中發(fā)揮了重要的調控作用，線粒體膜電位和ATP產生量是衡量線粒體功能的關鍵指標。結果可見Aβ25-35處理可導致細胞MMP顯著降低，而不同濃度GTP預處理可阻止Aβ25-35導致的MMP降低（圖3A）。與此同時，GTP預處理可在一定程度上挽救Aβ25-35導致的胞內ATP含量降低（圖3B）。以上結果共同證明了GTP對Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞線粒體功能紊亂的挽救作用。

2.4 GTP對 Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞Bcl-2和Bax表達及細胞色素C釋放的影響

GTP對線粒體相關凋亡信號途徑關鍵蛋白表達的影響見圖4。

圖4 GTP對線粒體相關凋亡信號途徑關鍵蛋白表達的影響Fig.4 Effect of GTP on the expression of key proteins in mitochondria-associated apoptotic signaling pathway

與對照組相比，Aβ25-35建模細胞Bcl-2表達水平顯著降低，同時Bax表達上調，與流式細胞技術定量檢測結果相一致。給予不同濃度的GTP處理后，Bcl-2表達水平隨著GTP濃度的增加逐漸升高，同時Bax表達水平逐漸降低，證明了GTP可通過上調Bcl-2表達、抑制Bax表達，從而對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡起到保護作用（圖4A）。細胞色素C從線粒體釋放入細胞質中，從而誘發(fā)細胞凋亡。結果可見，給予Aβ25-35刺激后，SH-SY5Y細胞質中cyto C含量增加；不同濃度GTP預處理可降低胞質中cyto C含量，證明GTP可抑制cyto C從線粒體向胞質中的釋放（圖4B）。

3 結論與討論

Aβ是AD發(fā)病機制的核心參與者，其中Aβ25-35是由11個氨基酸組成的較短毒性片段，包含完整蛋白質的β片層[11]。使用Aβ25-35處理SH-SY5Y細胞，細胞活力顯著降低，凋亡程度嚴重增加，首先證明了Aβ25-35對細胞的毒性作用。用GTP預處理則可逆轉這些毒性效應，證明GTP對Aβ25-35誘導的細胞毒性具有神經保護作用，對AD可能具有潛在治療價值。

進一步對GTP的神經保護作用機制進行探討。Aβ積聚導致神經元過度凋亡，與AD腦內神經元丟失密切相關[12]。研究表明，Aβ25-35可通過誘發(fā)細胞產生過量的ROS，增加氧化應激，進而導致線粒體功能障礙[13-14]；同時可促進線粒體釋放凋亡相關因子，誘發(fā)線粒體相關凋亡途徑，引起細胞凋亡[15]。研究結果表明，GTP可通過抑制ROS的產生發(fā)揮神經保護作用，且GTP預處理可以降低Aβ25-35誘導的線粒體超氧化物升高，減少Aβ25-35暴露后的氧化應激壓力。為了進一步明確GTP對線粒體功能的維系作用，研究考察GTP對MMP和ATP水平的影響作用，可見GTP能夠顯著抑制Aβ25-35損傷導致的MMP降低，同時抑制ATP水平的下降。這些研究結果證明GTP可有效改善Aβ25-35損傷引起的線粒體功能紊亂。Cyto C是線粒體電子傳遞鏈的重要組成[16]。正常情況下，其位于線粒體的膜間隙，在凋亡過程中則從線粒體外模釋放入細胞質中，cyto C向胞質的釋放是引發(fā)凋亡的關鍵步驟[17]。MMP降低和ROS水平的升高均可通過不同作用途徑誘導cyto C向胞質的釋放[18]。除此之外，其向胞質的釋放還依賴于線粒體外膜特異性通道的調控，該通道主要由Bcl-2家族成員形成。其中，Bcl-2（抗凋亡蛋白）和Bax（促凋亡蛋白）是Bcl-2家族的核心成員[19]。Bcl-2的上調可以穩(wěn)定線粒體外膜，阻斷cyto C自線粒體釋放入胞質，從而抑制細胞凋亡；而Bax的上調則可以促進cyto C向胞質的釋放，誘發(fā)凋亡[20]。研究結果顯示，不同濃度的GTP預處理不僅可以挽救Aβ25-35誘導導致的MMP降低和ROS水平升高，同時可以上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達、抑制促凋亡蛋白Bax的表達，抑制cyto C從線粒體向胞質中的釋放，降低胞質中cyto C含量，降低細胞凋亡，最終對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞凋亡起到保護作用。

綜上，本研究證明了GTP對Aβ25-35誘導SHSY5Y細胞的保護作用效應，并從線粒體功能維系及線粒體相關凋亡信號途徑闡明了作用機制，為抗AD有效藥物的研發(fā)提供了理論依據。