謝鳳蓮，孫萬成，羅毅皓

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧810016）

牦牛是生長在青藏高原地區(qū)的一種特有牛種，這 里海拔高，氣候寒冷，因此造就了牦牛不同于普通牛種的獨特體質(zhì)，并含有大量的營養(yǎng)成分和豐富的微量元素，特別是含有人體必需的脂肪酸，對人體的健康非常重要，但是牦牛肉比一般牛肉更粗糙且不好吃[1-2]。許多學(xué)者認(rèn)為牦牛肉蛋白質(zhì)含量高（22.13%），脂肪含量低（3.36%），其營養(yǎng)成分高于黃牛肉、豬肉、羊肉，屬“高蛋白、低脂肪”的優(yōu)質(zhì)肉[3-4]。去飽和脂肪酶1（stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1）是合成單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）棕櫚油酸和油酸的關(guān)鍵酶，參與泌乳反芻動物肝臟中的脂肪酸生物合成，且SCD1基因在肝臟中高表達[5-6]。大量研究表明，SCD1基因過表達可以增加細胞內(nèi)MUFA含量和脂質(zhì)積累，而沉默SCD1基因?qū)е掠退釢舛群透视腿ィ╰riglyceride，TAG）積累的顯著降低[7]。牦牛SCD1基因全長序列為1 300 bp，編碼359個氨基酸[8]，且缺乏SCD1基因的小鼠不能使飽和脂肪酸去飽和，并且避免飲食誘導(dǎo)的肥胖[9]。研究表明，牛乳中超過70%的共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）都是經(jīng)SCD1催化產(chǎn)生的，SCD1可能影響牛奶中SFAs/MUFAs比率、肌間脂肪沉積和成分，是改善牛奶和牛肉質(zhì)量的主要候選基因，牛肉肌間脂肪中不飽和脂肪酸含量的提高對于改善牛肉品質(zhì)和風(fēng)味也有著重要影響[10]。也有相關(guān)研究表明，小鼠的SCD1基因敲除會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)的膽固醇丁酯和甘油三酯的缺乏，棕櫚酸、油酸的含量也存在著相應(yīng)的下降趨勢，而棕櫚酸酯和硬脂酸的含量卻呈上升趨勢[11]。敲除小鼠SCD1基因，發(fā)現(xiàn)小鼠的耗能會增加，小鼠體內(nèi)的脂肪沉積減少，并能夠加大脂肪酸氧化速度，減少極低密度脂蛋白的分泌，增加從而間接參與脂肪代謝和其生物合成[12]。因此，研究牦牛SCD1基因表達差異，可以探究SCD1基因的調(diào)控脂肪酸含量比例的能力，并對牦牛肉品質(zhì)進行評估，為進一步改善牦牛肉品質(zhì)提供可借鑒的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1月份、4月份、9月份在青海省西寧市城南馬家肴屠宰場，采集現(xiàn)殺的3頭公牦牛的肝臟、腎臟、結(jié)腸、背最長肌組織（采集樣品所用的手術(shù)刀、鑷子等嚴(yán)格滅菌），迅速裝于冷凍管中，保存在液氮罐中，帶回實驗室后，將樣品從液氮罐中取出，保存于－80℃冰箱中，備用。

移液槍和微量吸頭、核酸染料（4s red plus nucleic acid stain）：上海生物工程技術(shù)股份有限公司；RNA提取試劑盒、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒、瓊脂糖、熒光定量染料（SYBR Green II）：蘭州寶生物工程有限公司；牛硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）酶聯(lián)免疫分析（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒：南京翼飛雪生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9070A）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；冷凍離心機（2-16KL）：德國SiGMA公司；PCR 儀（Gene AMP PCR System 9700）：美國 ABI公司；NanoDrop One/Onec超微量分光光度計（AZY1603147）：基因有限公司；電泳儀（JY600）：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像分析儀（WD-9413A）：北京市六一儀器廠；熒光定量儀（CFX96）：美國BIO-RAD公司；酶標(biāo)儀（352型）：芬蘭 Labsystems Multiskan MS；洗板機（AC8）：芬蘭 Thermo Labsystems；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9080型）：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索SCD1基因mRNA序列（GenBank登錄號為AY241933），通過核心序列設(shè)計5'和3'端特異性引物，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.3.2 樣品總RNA的提取和cDNA的合成

組織樣品的RNA提取參照試劑盒說明書進行操作。使用Nanodrop One/Onec超微量分光光度計測定RNA樣品的OD值（260 nm吸光度值與280 nm吸光度值之比，反映核酸的純度）和濃度（ng/μL），并在電泳凝膠成像儀上拍照檢測RNA的完整性。將提取到的牦牛組織樣品的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，主要參考TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，采用20 μL反轉(zhuǎn)錄體系，進行PCR擴增得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下：37℃，15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）；85℃，5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)）。

1.3.3 SCD1基因?qū)崟r熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

以合成的牦牛組織樣品cDNA為模板，按TaKaRa試劑盒推薦方法在冰盒上進行操作。加入引物SCD1F1-SCD1R1進行實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR），同時選擇內(nèi)參 β-actin F1-β-actin R1進行RT-PCR作為對照。兩步法PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）反應(yīng)

ELISA反應(yīng)按照ELISA試劑盒，應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中牛硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）水平。用純化的牛硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1），再與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的 SCD1抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物 3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺（3，3'，5，5'-tetramethylbenzidine，TMB）顯色。TMB在 HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的硬脂酰輔A去飽和酶1（SCD1）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中牛硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）濃度。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

利用SPSS 24.0軟件分析試驗數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用ANOVA對試驗結(jié)果進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的樣品總RNA檢測

提取出的牦牛肝臟、腎臟、結(jié)腸、背最長肌樣品的總RNA在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.2%瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果見圖1。

圖1樣品總RNAFig.1 Sample RNA

由圖1可以看到28 S、18 S、5 S三條亮帶，且28 S條帶亮度大概是18 S條帶亮度的2倍。

2.2 SCD1基因cDNA的合成

圖2由提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄后合成cDNA，再通過PCR擴增成DNA得到的電泳圖。

圖2 SCD1基因cDNA的合成Fig.2 SCD1 genes cDNA synthesis

本試驗應(yīng)用DL2 000的Marker可以看出目的基因在100 bp～250 bp之間。

2.3 牦牛SCD1基因熒光定量分析

不同月份牦牛不同組織間SCD1基因熒光定量見表2。

表2 牦牛SCD1基因熒光定量Table 2 Fluorescence quantification of SCD1 gene in yak

通過比較閾值法（2-ΔΔCt）進行相對定量。循環(huán)次數(shù)（cycle times，Ct）為樣品中PCR擴增反應(yīng)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。以牦牛肝臟樣品作為對照樣，將其2-ΔΔCt值設(shè)為1進行閾值比較，根據(jù)公式計算：

由上述公式計算得到的結(jié)果可以得到不同月份SCD1基因相對定量的拷貝數(shù)（見圖3）。

圖3 牦牛SCD1基因mRNA相對表達量Fig.3 Relative mRNA expression of yak SCD1 gene

由表2和圖3可得以每個月份的牦牛肝臟為對照組，1月份、4月份、9月份牦牛SCD1基因表達量在牦牛肝臟、結(jié)腸、腎臟、背最長肌4個組織中均有表達，其中背最長肌組織中mRNA相對表達量最高，且1月份牦牛SCD1基因在各個組織的表達量都低于4月份和9月份，且組織間SCD1基因表達量差異顯著（P＜0.05）。

2.4 牦牛SCD1蛋白含量分析

不同月份牦牛不同組織間SCD1蛋白含量見表3。

表3 牦牛SCD1蛋白含量Table 3 SCD1 protein content of yak （U/L）

同組織不同月份的牦牛SCD1蛋白含量見圖4。

圖4 牦牛SCD1蛋白含量Fig.4 SCD1 protein content of yak

由表3和圖4可得，以肝臟為對照組，1月份、4月份、9月份牦牛SCD1蛋白含量在背最長肌中的普遍高于對照組，1月份牦牛SCD1基因在各個組織的蛋白含量都低于4月份和9月份，且組織間SCD1蛋白含量差異顯著（P＜0.05）。

ELISA試驗結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果基本一致，相互印證。因此，牦牛SCD1基因在牦牛肝臟、腎臟、結(jié)腸和背最長肌4個組織中均有表達。以牦牛肝臟為對照組，不同月份間，牦牛SCD1基因在背最長肌組織中的表達量和蛋白含量普遍最高，1月份牦牛4個組織中SCD1基因表達量和蛋白含量都較低，不同環(huán)境會影響SCD1基因表達。

3 結(jié)論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，以牦牛肝臟為對照組，SCD1基因在牦牛肝臟、腎臟、結(jié)腸、背最長肌4個組織中均有表達，且SCD1基因表達量和含量在背最長肌組織中最高，差異顯著（P＜0.05）。說明牦牛SCD1基因不同月份不同組織存在差異性，SCD1基因表達雖然影響肉品質(zhì)，但是其不是唯一調(diào)控肌間脂肪含量的因素。1月份牦牛SCD1基因表達量和SCD1蛋白含量都低于9月份和4月份。青藏高原1月份的氣候較4月份和9月份冷，草地枯黃，牦牛飼料缺乏，這可能是導(dǎo)致1月份牦牛SCD1基因表達較低的緣由，說明牦牛SCD1基因的表達可能會受到氣候、飼料的影響，且在寒冷季節(jié)SCD1基因表達量可能會降低，同時降低了SCD1蛋白含量。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SCD1的表達和酶活性受生長發(fā)育時期、牛品種、營養(yǎng)、激素、外部環(huán)境等諸多因素的影響[13-15]，高碳水化合物飲食、胰島素、過氧化物酶和膽固醇直接影響SCD1基因轉(zhuǎn)錄[16]。SCD1基因表達水平高，會導(dǎo)致脂肪儲存和肥胖，反之，敲除SCD1基因，減少脂肪堆積，并使脂肪酸氧化從而保護飽和脂肪引起的肥胖[17]。也有研究表明，SCD1基因表達量與背最長肌的C16：1、C18：1和UFA含量呈正相關(guān)，與MUFA含量呈正相關(guān)，與PUFA含量呈負相關(guān)，該基因是肉品質(zhì)評定的候選指標(biāo)之一[18]。因此進一步研究SCD1基因在牦牛中的表達差異以及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子對肌間脂肪共同調(diào)控機理，可以試圖去揭示牦牛高蛋白、低脂肪的機理，為改善牦牛肉營養(yǎng)品質(zhì)提供理論依據(jù)。