黃秋艷，楊一華，黃沁璽，劉博，覃愛平

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021)

薄型子宮內(nèi)膜是指子宮內(nèi)膜厚度低于能夠獲得妊娠的厚度閾值，但目前此厚度閾值尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，大部分研究認(rèn)為卵泡中期內(nèi)膜厚度≤7 mm可稱為薄型子宮內(nèi)膜[1-2]，其在ART中的發(fā)生率約為2.4%[1]。近年來的研究認(rèn)為單純子宮內(nèi)膜厚度對(duì)ART的妊娠結(jié)局并沒有預(yù)測(cè)價(jià)值，不建議僅依據(jù)子宮內(nèi)膜厚度來評(píng)估子宮內(nèi)膜容受性、預(yù)測(cè)ART妊娠結(jié)局或取消胚胎移植周期[2]，建議結(jié)合內(nèi)膜的形態(tài)類型、血流情況等作綜合評(píng)價(jià)。然而，在內(nèi)膜厚度≤7 mm時(shí)，臨床妊娠及活產(chǎn)率顯著降低[3]，妊娠期發(fā)生產(chǎn)科并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加[4]。薄型內(nèi)膜的病因包括多次宮腔操作史、宮腔炎癥及放療、枸櫞酸氯米芬等藥物作用以及腺上皮生長不良等，另有部分患者病因不明[1，5]。薄型子宮內(nèi)膜的厚度不足以讓胚胎更靠近供養(yǎng)豐富的螺旋動(dòng)脈，其產(chǎn)生的活性氧自由基不利于胚胎種植，亦可能與炎癥環(huán)境異?；罨脱趸瘧?yīng)激反應(yīng)異常降低有關(guān)[6]。

薄型子宮內(nèi)膜常規(guī)治療藥物包括大劑量雌激素、促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑、人絨毛膜促性腺激素、宮腔灌注粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)以及改善血流灌注的治療藥物如低劑量阿司匹林、維生素E、枸櫞酸西地那非[5]。但仍有部分患者常規(guī)治療后子宮內(nèi)膜仍極薄，根據(jù)2018年國內(nèi)生殖醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜揖帉懙摹拜o助生殖技術(shù)中異常子宮內(nèi)膜診療的中國專家共識(shí)”，對(duì)于反復(fù)薄型子宮內(nèi)膜的患者建議選擇聯(lián)合治療方案，富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)、骨髓或者經(jīng)血來源的干細(xì)胞成為推薦的治療方案之一[2]。作為薄型內(nèi)膜前沿的治療方向之一，近年來PRP及干細(xì)胞治療等研究增多，相對(duì)于異體源的血漿/細(xì)胞，自體來源具有低免疫原性、低排斥反應(yīng)、倫理爭(zhēng)議少及制備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本文對(duì)自體源的血漿/細(xì)胞在薄型子宮內(nèi)膜治療中的應(yīng)用進(jìn)行綜述分析。

一、自體PRP

PRP由新鮮全血提取，血小板含量是普通血漿的3～5倍，其富含高濃度的生長因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、某些蛋白質(zhì)和肽(如纖維蛋白原、纖連蛋白、骨粘連蛋白、骨鈣素、血小板反應(yīng)蛋白)以及某些趨化因子和細(xì)胞因子等[7-8]。PRP現(xiàn)多應(yīng)用于骨骼、肌腱、創(chuàng)面、瘢痕、皮膚等組織再生修復(fù)[7-10]。自體PRP中高濃度的生長因子和細(xì)胞因子可刺激子宮內(nèi)膜細(xì)胞或子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的有絲分裂和增殖，進(jìn)而激活內(nèi)分泌旁分泌通路，改善子宮內(nèi)膜反應(yīng)，促進(jìn)胚胎著床和妊娠[11]。PRP亦可減少子宮內(nèi)膜損傷所致纖維化，增加宮腔局部的抗炎效果，提高子宮內(nèi)膜容受性[12]。另外，體外試驗(yàn)證實(shí)活化的PRP促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、子宮內(nèi)膜基質(zhì)成纖維細(xì)胞、子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(EnMSCs)和骨髓源性MSC的遷移，促進(jìn)子宮基質(zhì)及EnMSCs的增殖[13-14]。

我國中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院梁曉燕教授團(tuán)隊(duì)于2015年首次報(bào)道了應(yīng)用自體PRP宮腔灌注治療5例薄型子宮內(nèi)膜患者，治療后所有患者子宮內(nèi)膜厚度增加并經(jīng)IVF-ET成功妊娠[15]。之后她們團(tuán)隊(duì)又兩次報(bào)道了凍融胚胎移植(FET)周期中薄型子宮內(nèi)膜患者應(yīng)用PRP治療的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組子宮內(nèi)膜厚度、生化妊娠率、臨床妊娠率及胚胎種植率均高于對(duì)照組[11，16]。與國外學(xué)者Eftekhar等[17]、Zadehmodarres等[18]的研究結(jié)果類似。2018年Aghajanova等[19]報(bào)道2例嚴(yán)重宮腔粘連所致薄型子宮內(nèi)膜的患者(34歲和40歲)經(jīng)宮腔灌注自體PRP后自發(fā)妊娠或在IVF-ET幫助下獲得妊娠。

二、自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells，BMMCs)/骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)

1. BMMCs：作為體內(nèi)重要的干細(xì)胞龕，骨髓液含有多種祖細(xì)胞，梯度密度分離法處理后的獲取的BMMCs含有造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)等各種成體干細(xì)胞。這些細(xì)胞多可以合成釋放多種促進(jìn)EPCs遷移、分化和血管新生的因子如VEGF[20]，可用于組織器官再生及修復(fù)、促進(jìn)血管新生、改善局部微環(huán)境等[21]。血管發(fā)生是以HSCs為中心，邊緣為EPCs的血島形成，經(jīng)過多重血島互相融合形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。骨髓源細(xì)胞可定植入血管，作為支持細(xì)胞促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)血管的發(fā)生，改善缺血組織的血液循環(huán)及緩解缺血狀態(tài)[22-23]。骨髓移植的患者子宮內(nèi)膜活檢樣本中檢測(cè)到供體來源的子宮內(nèi)膜細(xì)胞，推測(cè)骨髓源干細(xì)胞在細(xì)胞更新和炎癥刺激下參與子宮內(nèi)膜再生[24]。2014年Singh等[25]報(bào)道6例Asherman’s綜合征患者，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下于子宮內(nèi)膜下注射自體BMMCs，5例患者術(shù)后3個(gè)月恢復(fù)月經(jīng)來潮，內(nèi)膜由術(shù)前的1～2 mm增厚至3.7～6.7 mm不等。2017年Zhao等[26]將附著有高濃度自體BMMCs的膠原蛋白材料移植入5例重度宮腔粘連患者宮腔中，治療后子宮內(nèi)膜明顯增厚，行IVF-ET助孕均獲得妊娠并活產(chǎn)；機(jī)制分析顯示BMMCs通過降調(diào)ΔNp63的表達(dá)促進(jìn)內(nèi)膜的修復(fù)，膠原蛋白支架在術(shù)后8周降解。

2. BM-MSCs：MSCs具有多向分化、造血支持、低免疫原性、旁分泌，以及向損傷組織部位遷移并定植即“歸巢”等特點(diǎn)，因有特殊的分子表型表達(dá)，可通過特定標(biāo)志物分離篩選[27]。近年來，多類MSCs已經(jīng)證實(shí)對(duì)薄型子宮內(nèi)膜及宮腔粘連治療有效果[28]。BM-MSCs來源于骨髓，作為最早發(fā)現(xiàn)的MSCs，目前在再生醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域研究應(yīng)用較多[29]。有研究報(bào)道，人源CD133+BM-MSCs可遷移至受損傷的子宮內(nèi)膜血管周圍，通過旁分泌血小板反應(yīng)蛋白1和胰島素樣生長因子1(IGF1)等旁分泌分子誘導(dǎo)內(nèi)膜周圍細(xì)胞增殖[30]，宮腔移植BM-MSCs后細(xì)胞角蛋白和波形蛋白(子宮內(nèi)膜細(xì)胞的標(biāo)記蛋白)表達(dá)較高，同時(shí)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜活動(dòng)的重要因子整合素ανβ3和白血病抑制因子(LIF)表達(dá)升高，提高抗炎作用，促進(jìn)子宮內(nèi)膜增厚[31]。2011年Nagori等[32]首次報(bào)道在1例宮腔粘連所致薄型子宮內(nèi)膜患者的治療中，通過免疫磁珠法自骨髓液分離篩選CD9+、CD90+和 CD133+的自體BM-MSCs，于月經(jīng)第2天經(jīng)宮腔灌注移植，治療后月經(jīng)量增多，術(shù)后6個(gè)月內(nèi)膜由治療前的3.6 mm增厚至7.1 mm，之后IVF-ET助孕成功。

三、自體外周血間充質(zhì)干細(xì)胞(peripheral blood mesenchymal stem cells，PB-MSCs)

MSCs可來源于多類組織，可通過G-CSF從骨髓動(dòng)員至外周血來源，為PB-MSCs。PB-MSCs和BM-MSCs有相似特性[33]。研究者發(fā)現(xiàn)經(jīng)G-CSF動(dòng)員后由外周血采集單個(gè)核細(xì)胞，分選出CD133+PB-MSCs灌注入子宮螺旋動(dòng)脈，可顯著改善嚴(yán)重Asherman綜合征和宮腔粘連患者的內(nèi)膜厚度及妊娠結(jié)局：16例治療患者中有3例術(shù)后自發(fā)懷孕，7例患者IVF-ET后懷孕[34]。經(jīng)動(dòng)員后外周血采集干細(xì)胞數(shù)量有限，明顯低于骨髓來源[33]，該研究分選出CD133+PB-MSCs，相對(duì)提高了MSCs的純度，故效果顯著。

四、自體子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrial stem cell，EMSCs)/月經(jīng)血來源間充質(zhì)干細(xì)胞(menstrual blood-derived stromal cells，menSCs)

EMSCs可從經(jīng)血和子宮內(nèi)膜活檢中獲得[35-36]，menSCs具有BM-MSCs類似MSCs表型和多分化潛能，低氧條件下仍具有較強(qiáng)的旁分泌功能和較優(yōu)的細(xì)胞遷移及增殖能力，同時(shí)具有抗炎、抗纖維化，免疫調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì)[37]。經(jīng)血源干細(xì)胞在體外細(xì)胞因子及雌激素共培養(yǎng)條件下可向子宮內(nèi)膜細(xì)胞分化，Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)menSCs可促進(jìn)子宮內(nèi)膜損傷小鼠的子宮內(nèi)膜血管生成，厚度增加，提高小鼠的生育力。2016年Tan等[39]報(bào)道收集月經(jīng)第2天經(jīng)血，經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增提純menSCs，于月經(jīng)第16天B超引導(dǎo)下宮底注射，治療7例宮腔粘連Ⅲ-Ⅳ度的患者，其中5例患者子宮內(nèi)膜厚度增加≥7 mm，3例患者治療后妊娠(自然受孕1例，胚胎移植受孕2例，妊娠率43%)。上述研究表明經(jīng)血源干細(xì)胞可作為治療重度宮腔粘連干細(xì)胞來源，Phermthai等[40]首次成功從不育婦女身上分離提取自生和無外源EMSCs株系(autogenic and xeno-free EMSC lines)，為臨床應(yīng)用自體子宮內(nèi)膜干細(xì)胞提供了可能。

五、小結(jié)及展望

各類自體血漿/細(xì)胞治療在薄型子宮內(nèi)膜的臨床治療中取得了一定效果，自體源PRP及骨髓、外周血單核細(xì)胞的采集制備和通過磁珠篩選MSCs除保證自體來源外，均無需體外擴(kuò)增培養(yǎng)，避免了細(xì)胞培養(yǎng)中的生物污染，臨床應(yīng)用前景良好。但是，對(duì)于需體外擴(kuò)增的menSCs，如何降低生物污染的幾率？在保證自體移植下，成體干細(xì)胞數(shù)量少，如何提高細(xì)胞的存活力及移植后增殖力？由于子宮特殊的解剖結(jié)構(gòu)，如何使血漿/細(xì)胞持續(xù)良好地發(fā)揮作用？能否通過優(yōu)化移植方式提高治療的效果？

針對(duì)上述問題，有幾點(diǎn)值得思考：(1)自體MSCs的體外擴(kuò)增：因自體MSCs的常規(guī)體外擴(kuò)增需要添加胎牛血清之類的生物制品，增加了非人類病原體和病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)，亦可引起局部炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致移植細(xì)胞移植時(shí)排斥反應(yīng)增加[41]。人臍帶血源血清富含高效的細(xì)胞因子和生長因子，在臨床應(yīng)用中可有助于高質(zhì)量及低風(fēng)險(xiǎn)的自體MSCs產(chǎn)生[42]。(2)自體MSCs移植后效率：PRP可促進(jìn)MSCs分化、血管生成、抗炎、組織重建等[43]，PRP促進(jìn)menSCs的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，提高menSCs細(xì)胞干性及多能性，聯(lián)合自體PRP可提高M(jìn)SCs并且改善子宮內(nèi)膜容受性及相關(guān)蛋白的表達(dá)[44]。另外，有研究報(bào)道經(jīng)過轉(zhuǎn)染VEGF基因的BM-MSCs移植治療薄型子宮內(nèi)膜提高了子宮內(nèi)膜容受性，可能比單純干細(xì)胞治療效果更好[45]。(3)治療方式：宮腔灌注及內(nèi)膜下注射可直接提高局部組織的干細(xì)胞濃度，保證植入部位的準(zhǔn)確，但是由于子宮腔的特殊解剖結(jié)構(gòu)，液狀的血漿及細(xì)胞懸液無法長期粘附在子宮肌層及內(nèi)膜表面，聯(lián)合應(yīng)用可降解生物支架材料等進(jìn)行細(xì)胞宮腔內(nèi)移植，延長細(xì)胞與創(chuàng)面的接觸時(shí)間，可提高修復(fù)作用[26]。另外，有報(bào)道稱全身給藥比局部注射能更好地使骨髓源干細(xì)胞歸巢至子宮內(nèi)膜[46]，但是仍需將全身用藥可能發(fā)生的炎癥反應(yīng)等考慮在內(nèi)，同時(shí)需要更多的研究支持。(4)治療時(shí)間：生理狀態(tài)下子宮內(nèi)膜在月經(jīng)期脫落后，在雌激素的作用下進(jìn)行增殖修復(fù)，月經(jīng)期移植自體源細(xì)胞[34]取得較好的臨床效果，宮腔創(chuàng)面局部處理及搔刮亦可取得類似效果[26]。

自體源PRP及單核細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞在目前薄型子宮內(nèi)膜的臨床研究中取得一定效果，充分發(fā)揮了自體來源這一得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)，結(jié)合各類血漿/細(xì)胞的優(yōu)缺點(diǎn)，選擇更高效、更優(yōu)化組合等治療方式，可最大程度提高治療的效果。