(中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100190)

近年來(lái),隨著人們膳食結(jié)構(gòu)和飲食觀念的改變,功能性食品的研究與開(kāi)發(fā)成為當(dāng)代食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。紅茶菌(又名康普茶,Kombucha、tea fungus)是一種通過(guò)多種微生物組成的“共生菌落(symbiotic associations)”發(fā)酵茶糖水而成的富含益生生物及活性成分的功能性飲料[1]。它在我國(guó)的飲用最早可追溯到公元前220年左右的秦朝,在當(dāng)時(shí)被人們認(rèn)為是能夠解毒和賦予人能量的珍寶[2]。近年來(lái)隨著現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,紅茶菌中有益微生物及其活性成分的研究日益深入。

紅茶菌的“共生菌落”主要包括醋酸菌、酵母菌和乳酸菌。這些微生物之間形成的強(qiáng)大共生關(guān)系及復(fù)雜代謝通路使得紅茶菌中含有大量的活性成分,主要包括葡萄糖酸、醋酸、葡萄糖、果糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素、茶多酚、咖啡因、乙醇和二氧化碳等[3-4]。而越來(lái)越多的研究表明紅茶菌對(duì)多種疾病都具有潛在的治療效果,包括抗氧化、抗致癌、抗糖尿病、提高免疫力、增強(qiáng)肝臟解毒能力,有助于胃潰瘍和高膽固醇的治療等[5-6]。正因紅茶菌所具有的特殊功能,近年來(lái)紅茶菌的市場(chǎng)呈指數(shù)增長(zhǎng),預(yù)計(jì)到2024年,全球紅茶菌的市場(chǎng)預(yù)計(jì)將達(dá)到44.6億美元[7]。

但我國(guó)紅茶菌的生產(chǎn)仍停留在家庭自產(chǎn)自銷(xiāo)的階段,市場(chǎng)上鮮有相關(guān)成功產(chǎn)品。在粗放式的生產(chǎn)方式下,主要因操作不當(dāng)發(fā)酵過(guò)程很容易發(fā)生污染和變質(zhì);因缺乏科學(xué)的培育和管理,菌種很容易發(fā)生變異、衰退和死亡;缺乏對(duì)紅茶菌復(fù)雜微生物群落的認(rèn)識(shí)和控制,難以保證產(chǎn)品的品質(zhì)及穩(wěn)定性[8]。因此深入研究紅茶菌中的微生物群落的多樣性及其功能,將有助于保證最終產(chǎn)品的品質(zhì)、安全性及穩(wěn)定性。近年來(lái),紅茶菌中微生物的研究從傳統(tǒng)的依賴培養(yǎng)的單個(gè)微生物的分離、篩選、馴化,發(fā)展到依賴現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的非培養(yǎng)依賴法的微生物群落分析。尤其是近些年來(lái)高通量篩選技術(shù)的快速發(fā)展,對(duì)以微生物發(fā)酵過(guò)程和機(jī)制的研究產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響,包括微生物群落組成及動(dòng)態(tài)變化、微生物生理功能及代謝能力、微生物對(duì)環(huán)境響應(yīng)機(jī)制等方面。另外,通過(guò)基因組和元基因組對(duì)微生物群落進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,也為發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化、微生物功能改造、食源性微生物疾病預(yù)防和控制等提供了重要的依據(jù)。因此,本文通過(guò)對(duì)近年來(lái)紅茶菌微生物多樣性及其研究方法的分析與總結(jié),以期為我國(guó)紅茶菌產(chǎn)業(yè)化的快速發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和方法參考。

1 紅茶菌中微生物菌群的相互作用

紅茶菌發(fā)酵體系中主體菌群包括醋酸菌、酵母菌和乳酸菌,這些微生物之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)系。其中酵母菌是“啟動(dòng)子”和橋梁(圖1),在發(fā)酵的初級(jí)階段(0～3 d)先將蔗糖等分解為葡萄糖和果糖,并進(jìn)一步生成乙醇和CO2;葡萄糖醋桿菌利用葡萄糖和果糖為碳源開(kāi)始快速生長(zhǎng)繁殖,并生成乙酸、葡萄糖酸等代謝產(chǎn)物;乳酸菌利用酵母菌代謝產(chǎn)生的維生素和氨基酸等物質(zhì)逐漸生長(zhǎng)繁殖,并產(chǎn)生一定量的乳酸;當(dāng)培養(yǎng)液中積累了一定量乙醇時(shí),乳酸菌的發(fā)酵能力逐漸衰弱,酵母菌重新繁殖并占絕對(duì)優(yōu)勢(shì);酵母菌生長(zhǎng)階段所產(chǎn)生的乙醇可以刺激葡萄糖醋桿菌產(chǎn)生更多的乙酸,乙酸又能刺激酵母菌產(chǎn)生乙醇[9]。乙酸、乙醇的存在可以保護(hù)葡萄糖醋桿菌和酵母菌免受其它菌株的侵染。另一方面,乳酸菌發(fā)酵水解生成的葡萄糖又可以供給酵母菌和葡萄糖醋桿菌進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖[1]。張妍等[10]從紅茶菌生物膜中分離得到葡糖桿菌屬(Gluconobacterasai)和路德類酵母(Saccharomycodesludwigii),單獨(dú)培養(yǎng)所分離出的醋酸菌產(chǎn)纖維素的速度和產(chǎn)量均遠(yuǎn)不及紅茶菌混合菌群,而將這兩種菌混合培養(yǎng)所得到的細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量卻大幅度提高。唐水佳等[11]發(fā)現(xiàn)以紅茶菌和木葡糖酸醋桿菌作為生產(chǎn)菌株制備的細(xì)菌纖維素?zé)o本質(zhì)區(qū)別,但是前者生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的效率顯著高于木葡糖酸醋桿菌,且產(chǎn)量是后者的3倍以上。這都說(shuō)明紅茶菌的混合菌群中存在著微生物之間的共生促進(jìn)關(guān)系?？偠灾?各菌群之間通過(guò)這種相互制約或促進(jìn)的關(guān)系完成了紅茶菌的發(fā)酵。

圖1 紅茶菌發(fā)酵體系中微生物菌群的相互作用關(guān)系Fig.1 Interaction of microflora in Kombucha fermentation system

2 紅茶菌中微生物菌群的分析方法

目前關(guān)于紅茶菌發(fā)酵體系中微生物的相關(guān)研究方法主要包括兩大類,一類是培養(yǎng)依賴分析法(culturing-depending analysis),一類是借助分子生物學(xué)手段的非培養(yǎng)依賴分析法(culturing-independing analysis)。

2.1 培養(yǎng)依賴分析法

目前,對(duì)紅茶菌中微生物深入研究的報(bào)道大部分還是基于培養(yǎng)依賴分析法完成的。采用培養(yǎng)依賴分析法,從紅茶菌中分離得到了大量的細(xì)菌和酵母菌(如表1所示)。在細(xì)菌中最主要的是醋酸菌屬(Acetobacter),另外還有葡糖醋桿菌(Gluconacetobacter)和乳酸菌(Lactobacillus)。其中醋桿菌主要包括木醋酸菌(A.xylinum)、液化醋桿菌(A.liquefaciens)、甲醇醋桿菌(A.methanolica)、醋化醋桿菌(A.aceti)、重氮營(yíng)養(yǎng)醋桿菌(A.diazot-rophicus)、東方醋桿菌(A.orientalis)。葡糖桿菌屬(Gluconobactersp.或Komagataeibactersp.)主要包括淺井式葡糖桿菌(G.asaii)、中間葡糖桿菌(G.intermedius)、木葡糖桿菌(G.xylinus)、中間葡糖桿菌(G.intermedius)、氧化葡糖桿菌(G.oxydans)、居間駒形氏桿菌(K.intermedius)和鼠李小松桿菌(K.rhaeticus)等[12-16]。乳酸菌主要包括內(nèi)氏乳桿菌(Lactobacillusnagelii)、酒明串珠菌(Oenococcusoeni)等[12-13,17]。乳酸菌在培養(yǎng)依賴法中報(bào)道的較少,也曾一度被認(rèn)為在紅茶菌中是非特征菌。采用培養(yǎng)依賴法分離到的酵母菌主要有:類酵母屬(Saccharomycessp.)的釀酒酵母(S.cerevisiae)、巴氏酵母菌(S.pasteurianus)、路德氏酵母(S.ludwigii)等,裂殖酵母屬(Schizosaccharomycessp.)的粟酒裂殖酵母(S.pombe)、假絲酵母屬(Candidasp.)的布魯克絲酵母屬(C.crusei)、熱帶假絲酵母菌(C.tropicans)、近平滑假絲酵母(C.parapsilosis)等,克勒克酵母屬(Kloeckerasp.)、德克酵母屬(Dekkerasp.)的布魯塞爾德克酵母(D.bruxellensis)、德巴利酵母屬(Debaryomycessp.)的漢遜德巴利酵母(D.hansenii)、接合酵母屬(Zygosaccharomycessp.)的Z.kombuchaensis和拜耳接合酵母(Z.bailii)、酒香酵母屬(Brettanomycessp.)的異酒香酵母(B.anomalus)等[12-13,18-21]。

表1 紅茶菌共生體系中的微生物構(gòu)成Table 1 Microbial composition in the symbiotic system of Kombucha

雖然傳統(tǒng)培養(yǎng)法在微生物多樣性方面沒(méi)有優(yōu)勢(shì),但在某些特定功能微生物的馴化和篩選方面具有不可替代的作用而被廣泛應(yīng)用。許多研究者基于培養(yǎng)依賴法對(duì)分離出的微生物進(jìn)行了大量的研究。張妍等[10]利用從紅茶菌中分離到的葡糖桿菌屬(G.asaii)和路德氏酵母(S.ludwigii)混合進(jìn)行細(xì)菌纖維素的生產(chǎn),發(fā)現(xiàn)兩者混合生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的速度和產(chǎn)量都明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)。Nguyen等[22]從紅茶菌中篩選、分離得到既能產(chǎn)細(xì)菌纖維素又能產(chǎn)葡萄糖醛酸的醋酸菌(G.intermedius)和一株高耐酸的布魯塞爾德克酵母(D.bruxellensis),以這兩株菌在最優(yōu)比例下共生培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)葡萄糖醛酸,其產(chǎn)量可達(dá)到175.8 mg·L-1。Pavels等[23]從紅茶菌中分離到一株鼠李小松桿菌(K.rhaeticus),該菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素的能力遠(yuǎn)高于兩種用于纖維素生產(chǎn)的參考菌株K.xylinusDSM 46604和K.hanseniiDSM 5602T。林娟等[24]利用從紅茶菌樣品中分離得到的釀酒酵母(S.cerevisiae)、葡糖醋桿菌(Gluconacetobactersp.)復(fù)配植物乳桿菌實(shí)現(xiàn)了多菌種的純菌混合發(fā)酵生產(chǎn)紅茶菌,且發(fā)酵周期縮短了5倍。

2.2 非培養(yǎng)依賴分析法

培養(yǎng)依賴分析法使紅茶菌中可培養(yǎng)微生物及其特性得以被認(rèn)知并加以應(yīng)用。已有報(bào)道稱,經(jīng)過(guò)大約10 d的發(fā)酵后,紅茶菌的微生物群落中細(xì)菌和酵母的數(shù)量通常會(huì)達(dá)到104～106cfu·mL-1,并且酵母的數(shù)量略多于細(xì)菌,茶湯中的微生物數(shù)量大于纖維素膜[29-30]。但是研究人員發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)依賴分析法并不能充分描述整體微生物群落結(jié)構(gòu)。因?yàn)槟承┪⑸镂锓N難以培養(yǎng)和分離,并且完全依賴于微生物的表型性狀也會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的識(shí)別。因而,以非培養(yǎng)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)手段在紅茶菌的研究中日益得到發(fā)展。目前在紅茶菌中已被開(kāi)發(fā)應(yīng)用的主要包括高通量測(cè)序技術(shù)(High throughput sequencing,HTS)、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(Terminal restriction fragment length polymorphism analysis,T-RFLP)、DNA宏條形碼(DNA metabarcoding analysis)、寡核苷酸配型技術(shù)(Oligotyping)等。

2.2.1 高通量測(cè)序技術(shù) 高通量測(cè)序技術(shù)又被稱為“下一代”測(cè)序(Next-generation sequencing)技術(shù)。它可以一次性對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條的 DNA分子進(jìn)行序列的測(cè)定,使得對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致而全面的分析成為了可能[31]。高通量測(cè)序技術(shù)以環(huán)境樣品中所有微生物的基因組為研究對(duì)象,分析環(huán)境樣品中所有微生物的總和,包括可培養(yǎng)和未培養(yǎng)微生物。目前被廣泛用于檢測(cè)發(fā)酵食品中微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育多樣性,組成和動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)變化,從而為描述和預(yù)測(cè)這些復(fù)雜物種之間的關(guān)系提供了機(jī)會(huì)[32-33]。

2014年Marsh等[34]第一次將高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于紅茶菌中微生物群落結(jié)構(gòu)組成的研究,對(duì)來(lái)自于不同國(guó)家的五個(gè)紅茶菌樣本發(fā)酵菌液及菌膜中微生物群落進(jìn)行了深入全面的解析。從紅茶菌中鑒定了包括放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、嗜熱雙球菌(Deinococcus-Thermus)、厚壁菌(Firmicutes)和變形桿菌(Proteobacteria)的5個(gè)細(xì)菌門(mén)。其中,變形桿菌最為豐富,在所測(cè)樣本的菌液和生物膜分別均能占90%和60%左右,占主導(dǎo)地位的兩個(gè)屬是醋酸桿菌(Acetobacter)和葡萄糖酸桿菌(Gluconacetobacter),其中葡萄糖酸桿菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)醋酸桿菌。而通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn),不同來(lái)源的紅茶菌中均檢測(cè)到了相當(dāng)大比例的乳酸菌,包括乳酸桿菌(Lactobacillus)和乳球菌(Lactococcus),其中主要的乳酸菌是開(kāi)菲爾基質(zhì)乳桿菌(L.kefiranofaciens)的一個(gè)亞種L.kefirgranum,并首次鑒定了明串珠菌(Leuconostoc)、支原體屬(Allobaculum)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)和腸球菌屬(Enterococcus)中的一些種。并且發(fā)現(xiàn)這些乳酸桿菌在紅茶菌發(fā)酵周期內(nèi)是普遍存在的,特別是在發(fā)酵的后期階段,這也改變了傳統(tǒng)的認(rèn)為紅茶菌中乳酸菌非特征菌的觀念。

從真菌的角度來(lái)看,非依賴培養(yǎng)分析法更加有益,因?yàn)榻湍妇谂囵B(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較細(xì)菌緩慢,這使得基于培養(yǎng)的酵母菌分離鑒定更為困難。紅茶菌菌液中子囊菌(Ascomycota)是唯一的真菌門(mén),其中接合酵母(Zygosaccharomycessp.)在所測(cè)樣品中比例均大于95%,其次是畢赤酵母屬(Pichiasp.),另外還有超過(guò)10%的未分類菌屬。在多樣性方面,紅茶菌中酵母菌的多樣性較高,且菌膜要高于菌液。因?yàn)樵诰ぶ羞€檢測(cè)到了包括塔森球腔菌(Davidiellatassiana)、毛絨厭氧桿菌(Lachanceafermentati)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、芽殖酵母(Naumovozymacastelli)、耐鹽真菌(Wallemiasebi)、草莓白冬孢酵母(Leucosporidiellafragaria)、發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、伯頓絲孢畢赤酵母(Hyphopichiaburtonii)等多種培養(yǎng)分析法中從未發(fā)現(xiàn)和報(bào)道的菌種。

宏基因組測(cè)序是利用新一代高通量測(cè)序技術(shù),以特定環(huán)境下微生物群體基因組為研究對(duì)象,在分析微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系的基礎(chǔ)上,可進(jìn)一步探究微生物群體功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系,對(duì)于微生物群落研究有著重要的意義[35-36]。另一方面,利用宏基因組技術(shù)還能夠發(fā)現(xiàn)功能基因,研究群落的代謝通路(Meta-pathway),能夠?yàn)槲⑸锶郝涞拇x特征提供更加詳細(xì)的解析。這也有利于將特定的代謝功能機(jī)制與環(huán)境背景聯(lián)系起來(lái),從而促進(jìn)微生物生態(tài)的研究[37]。宏基因組技術(shù)也已經(jīng)在紅茶菌微生物群落多樣性及其代謝途徑的研究中得到利用。徐偉等[38]對(duì)傳統(tǒng)紅茶菌進(jìn)行了宏基因組測(cè)序,將數(shù)據(jù)處理后得到的非冗余基因集蛋白序列與NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blastp同源性比對(duì),全面解析了紅茶菌中的微生物群落組成。并進(jìn)一步將非冗余基因集與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)了紅茶菌中碳水化合物代謝通路中存在338類代謝途徑,包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、磷酸戊糖途徑、氨基酸代謝及丁酸酯代謝等代謝途徑等,并檢測(cè)到307個(gè)Unigene注釋到次生代謝途徑。進(jìn)一步將這些途徑與代謝產(chǎn)物及微生物群落聯(lián)系起來(lái)研究其相互關(guān)系,發(fā)現(xiàn)這些代謝途徑為許多物質(zhì)的合成提供了原料,如芳香族氨基酸的合成,同時(shí)TCA循環(huán)和丙酮酸代謝途徑產(chǎn)生大量的檸檬酸、乙酸、丁酸等有機(jī)酸使溶液的pH逐漸降低;氨基酸代謝途徑與紅茶菌液中14種氨基酸有關(guān),其中有5種是人體必需氨基酸;維生素的代謝途徑與多種維生素如B1、B2、B5和B12等有關(guān);在次級(jí)代謝途徑中發(fā)現(xiàn)甾醇、萜類等物質(zhì)生物合成途徑等。由此可見(jiàn),基于高通量測(cè)序的宏基因?qū)W分析不僅可以快速準(zhǔn)確地解析傳統(tǒng)紅茶菌菌群結(jié)構(gòu)和各菌種的比例,同時(shí)闡明了紅茶菌菌群的代謝機(jī)理,從而可以更有效地控制紅茶菌的發(fā)酵進(jìn)程。

2.2.2 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù) 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù)(T-RFLP)是以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的較為先進(jìn)的微生物群落研究方法。它是PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、DNA限制性酶切技術(shù)和DNA序列自動(dòng)分析技術(shù)的綜合運(yùn)用[39]。相對(duì)于其它分子生物學(xué)技術(shù),T-RFLP具有很高的分辨率、容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等特點(diǎn),所以已經(jīng)成為分析復(fù)雜環(huán)境微生物群落的強(qiáng)有力的工具之一。目前,該技術(shù)已被成功應(yīng)用于菌種的鑒定、各種微生物群落的比較分析、微生物群落多樣性及結(jié)構(gòu)特征的研究等方面,是目前很有前景的微生物群落指紋圖譜分析技術(shù)[40]。

但是T-RFLP技術(shù)也存在一些缺陷,比如無(wú)法區(qū)分近緣種微生物，只能看出各類微生物所占比例,無(wú)法定量及準(zhǔn)確看出其變化趨勢(shì)等。因此,為了更好地表征紅茶菌中微生物群落的多樣性特征,Chakravorty等[41]將高通量測(cè)序技術(shù)與T-RFLP結(jié)合研究紅茶菌的發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。通過(guò)對(duì)酵母內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)和大亞組(LSU)核糖體RNA(rRNA)基因的D1-D2區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序以及細(xì)菌16S rRNA的V3區(qū)域進(jìn)行T-RFLP分析。研究結(jié)果表明,在總體水平上,發(fā)酵菌液的生物多樣性高于生物菌膜,酵母菌的多樣性高于細(xì)菌。就酵母菌而言,在門(mén)水平,子囊菌占據(jù)了>98%的比例;在科水平上,酵母菌科(Saccharomycetaceae)占整個(gè)酵母菌群落的95%左右;在屬的層面上,生物膜和發(fā)酵菌液中均以念珠菌屬占主導(dǎo);在種水平上,假絲酵母屬亞種(Candidastellimalicola)是發(fā)酵菌液和生物菌膜中最主要的菌種。對(duì)細(xì)菌而言,總的來(lái)說(shuō),發(fā)酵菌液中的細(xì)菌群落比生物菌膜群落更加多樣化。在門(mén)水平上,變形桿菌門(mén)(Proteobacteria)占據(jù)絕對(duì)的優(yōu)勢(shì),在發(fā)酵菌液中還檢測(cè)到了厚壁菌門(mén),藍(lán)藻和放線菌等;科水平上,醋桿菌科(Acetobacteraceae)在生物膜和菌液中均占絕對(duì)的主導(dǎo),在發(fā)酵菌液中也檢測(cè)到了其他科如顫藻科(Oscillatoriaceae)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)等;在屬水平上,駒形桿菌屬(Komagataeibactersp.)和葡糖桿菌(Gluconobactersp.)是該菌群中最主要的屬,發(fā)酵菌液中也檢測(cè)到了雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、柯林斯菌屬(Collinsella)、腸產(chǎn)氣桿菌屬(Enterobacter)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)等其他的屬。另外,生物菌膜和發(fā)酵菌液中還存在大量未分類的屬(生物膜中約33%,湯中34%)。

2.2.3 DNA宏條形碼 DNA宏條形碼分析技術(shù)是DNA條形碼技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合的一種新的研究思路[42]。其操作步驟大體分為以下幾步:樣本采集,樣本混合提取基因組DNA,PCR擴(kuò)增條形碼基因,高通量測(cè)序,生物信息學(xué)分析。DNA宏條形碼技術(shù)具有測(cè)序效率高、通量大、成本低，對(duì)物種鑒定快速、準(zhǔn)確，且能對(duì)不可培養(yǎng)微型生物進(jìn)行鑒定等特點(diǎn),這也使它在微生物群落研究中的應(yīng)用中有著廣泛前景[35]。DNA宏條形碼技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于紅茶菌微生物群落的研究。Reva等[43]通過(guò)對(duì)細(xì)菌16S rDNA和真菌ITS的元條碼數(shù)據(jù)集的分析發(fā)現(xiàn),雖然不同培養(yǎng)條件下紅茶菌微生物菌群的物種存在多樣性,但是對(duì)細(xì)菌而言,在不同條件下紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中核心細(xì)菌的組成一直保持不變。而與細(xì)菌群落相比,真菌群落隨生長(zhǎng)條件的變化差異性則很明顯,且真菌群落的豐度也因發(fā)酵條件不同而有差異。從而推測(cè)在紅茶菌中存在的芽孢桿菌和假單胞菌屬可能構(gòu)成了天然的抗真菌抗生素環(huán)境。這一個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于解析細(xì)菌-酵母的共生關(guān)系及其對(duì)人體微生物系統(tǒng)的影響都有一定的意義。Coton等[17]通過(guò)對(duì)細(xì)菌的16S V1-V3區(qū)域和真菌(尤其是酵母菌)的26S DNA D1/D2區(qū)域的元條形碼進(jìn)行高通量測(cè)序分析,深入研究以紅茶和綠茶為基質(zhì)的工業(yè)規(guī)模的紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌和真菌的群落多樣性和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,并發(fā)現(xiàn)了紅茶菌發(fā)酵液體和生物膜中的細(xì)菌群落組成存在強(qiáng)烈的基質(zhì)效應(yīng),這種基質(zhì)效應(yīng)的存在與較高水平的乳酸和乙酸直接相關(guān),也可能與酸性耐受酵母物種如Dekkerasp.的存在有關(guān),但是酵母群落卻不存在基質(zhì)效應(yīng)。這些分析結(jié)果都將對(duì)紅茶菌產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程優(yōu)化、監(jiān)控、品質(zhì)穩(wěn)定性起到重要作用。

2.2.4 寡核苷酸配型技術(shù) 高通量測(cè)序使微生物生態(tài)學(xué)家能夠在時(shí)間和空間尺度上探索微生物群落動(dòng)態(tài),但是通常無(wú)法解決復(fù)雜微生物數(shù)據(jù)集里密切相關(guān)的生物之間在生態(tài)學(xué)上有意義的差異[44]。寡核苷酸配型技術(shù)是一種新穎的監(jiān)督計(jì)算方法,與比較序列讀數(shù)中的所有位點(diǎn)以評(píng)估相似性的分類或聚類方法不同,它僅利用最具鑒別力的信息,聚焦于通過(guò)香農(nóng)熵(Shannon entropy)分析所揭示的可變位點(diǎn)來(lái)識(shí)別高度精細(xì)的分類單元[45-46]。因此,寡核苷酸配型技術(shù)可以被用來(lái)測(cè)定紅茶菌微生物群落中亞顯性群落的組成及多樣性。Filippis等[47]使用oligotyping技術(shù)對(duì)紅茶菌菌群中葡萄糖醋酸桿菌的亞屬多樣性進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然發(fā)酵溫度似乎不影響屬水平上顯性細(xì)菌群落的組成,但是在亞屬水平上存在兩種不同的葡萄糖醋桿菌(Gluconacetobacter)。并且在發(fā)酵過(guò)程中這兩種亞屬的豐度與發(fā)酵溫度密切相關(guān)。另外,通過(guò)Oligotyping技術(shù)也揭示了較高的溫度會(huì)促進(jìn)一些亞顯性細(xì)菌群的生長(zhǎng),主要是厚壁菌門(mén)(Firmicutes，包括乳桿菌屬、乳球菌屬、鏈球菌)和放線菌門(mén)。而這種不同溫度下亞屬性微生物的差異也造成了紅茶菌發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的差異,尤其是主要代謝產(chǎn)物葡萄糖酸和葡萄糖醛酸以及多酚類物質(zhì)。通過(guò)Oligotyping揭示出了紅茶菌茶發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)溫度調(diào)節(jié)可以選擇性地驅(qū)動(dòng)不同醋酸菌亞種,從而調(diào)節(jié)紅茶菌發(fā)酵液中產(chǎn)物的組成與濃度。這對(duì)于紅茶菌產(chǎn)品品質(zhì)的調(diào)控及穩(wěn)定性具有重要的意義。

3 總結(jié)與展望

當(dāng)前消費(fèi)者越來(lái)越傾向于無(wú)添加劑、高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和具有健康益處的“最小加工產(chǎn)品(minimally processed products)”。在這種背景下,紅茶菌引起了國(guó)內(nèi)外研究者和消費(fèi)者的關(guān)注。紅茶菌中微生物群落之間強(qiáng)大的共生關(guān)系及其豐富的代謝通路使其具有豐富的生物活性物質(zhì),并對(duì)多種疾病產(chǎn)生了潛在的治療效果。但是作為一種復(fù)雜的微生物及其代謝產(chǎn)物的混合物,紅茶菌中微生物群落組成及變化規(guī)律、代謝產(chǎn)物及其理化性質(zhì)的研究一直以來(lái)仍然是國(guó)內(nèi)外研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)和熱點(diǎn)。這也是從根本上保證產(chǎn)品的品質(zhì)、安全性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵問(wèn)題。

近年來(lái),紅茶菌中微生物的研究也從傳統(tǒng)的依賴培養(yǎng)的單個(gè)微生物的分離、篩選、馴化,發(fā)展到依賴現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的非培養(yǎng)依賴法的微生物群落分析。從單一的高通量測(cè)序以及以高通量測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的T-RFLP技術(shù)、DNA宏條形碼技術(shù)、寡核苷酸配型技術(shù)等,為深入全面認(rèn)知和解析紅茶菌微生物群落提供了方法和技術(shù)平臺(tái)。而這些分析方法在獲取微生物多樣性信息方面各有優(yōu)劣,因此為了獲取更加全面、準(zhǔn)確的微生物群落組成、結(jié)構(gòu)及變化等信息,需要結(jié)合實(shí)際研究目標(biāo),采取多層次多角度的研究手段,通過(guò)多種分析方法的互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、完整解析微生物群落及其代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。從而實(shí)現(xiàn)紅茶菌發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品品質(zhì)、安全及穩(wěn)定的可控性。

目前,應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)微生物多樣性的研究得到了空前發(fā)展。尤其是隨著新一代測(cè)序技術(shù)的推出和生物信息學(xué)的發(fā)展,迄今為止,越來(lái)越多復(fù)雜生態(tài)環(huán)境,如土壤、海洋、水體、腸道等中的微生物多樣性被解析[48-49]。但這些技術(shù)很多還沒(méi)有應(yīng)用于紅茶菌微生物多樣性的研究中,例如以比較基因組學(xué)的方法研究紅茶菌中微生物的水平基因轉(zhuǎn)移,以確定發(fā)酵體系中的有利基因與有害基因,更好地控制紅茶菌潛在的食品安全等問(wèn)題;利用全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu),對(duì)微生物群落的代謝能力進(jìn)行預(yù)測(cè)和模擬,實(shí)現(xiàn)菌株的改造或者發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化等。