藺 怡，趙宏玉，張紅城，江利華

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056000；2.北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心，北京 100093；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

蜂蜜，又稱為“石蜜”“巖蜜”，最早被記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。蜂蜜是一種天然甜味物質(zhì)，通過蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露等其他甜味分泌物混以自身唾液腺的分泌物，經(jīng)體內(nèi)酶或其他特殊物質(zhì)加工之后釀造而成，是最古老和使用最廣泛的食品之一[2-5]。已有報道指出，蜂蜜不僅富含葡萄糖、果糖，還含有少量蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸，以及多酚類化合物等超過200多種物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、抑菌消炎、補血潤肺、調(diào)節(jié)胃腸道、增強免疫力等多種生物活性[6-10]。因此，蜂蜜被廣泛認(rèn)為是營養(yǎng)價值高、生物活性廣的天然保健品[11-12]。

我國地域廣闊、蜜源植物多種多樣，椴樹作為我國東北地區(qū)重要的蜜源植物之一，為我國蜂蜜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用[13]。椴樹蜜主要以椴樹科中紫椴和糠椴為蜜源植物，因而椴樹蜜又可分為紫椴蜜和糠椴蜜，是我國實行等級劃分后唯一確定過的特等蜂蜜[14]。一般可觀察到，紫椴樹花朵面朝上，顏色呈淺琥珀色；糠椴樹花朵面朝下，顏色呈特淺琥珀色[15]。椴樹蜜具有濃郁的香味、易結(jié)晶，且結(jié)晶后紫椴蜜變?yōu)檠┌咨烽裁鄣念伾珓t偏黃一些[16-17]。以往研究表明，多酚類化合物可作為判別蜂蜜植物來源的內(nèi)在標(biāo)志之一，同時也是構(gòu)成蜂蜜生物活性作用的重要成分之一[18]。

近年來，關(guān)于椴樹蜜中的多酚類成分的研究不斷增加。例如，Trutvetter S等人[19]采用超高效液相色譜聯(lián)用四極桿飛行時間質(zhì)譜的方法測定不同蜂蜜樣品中酚酸和黃酮類化合物，證實了椴樹蜜中存在大量的脫落酸。Bertoncelj J等人[20]通過固相萃取法分別對7種斯洛文尼亞蜂蜜中的黃酮類化合物提取，再結(jié)合液相色譜-二極管陣列檢測法和電噴霧電離質(zhì)譜法，在椴樹蜜中鑒定出木犀草素、槲皮素、柚皮素、芹菜素、山姜素和柯因，其中槲皮素在椴樹蜜、洋槐蜜和森林蜜中含量相似。Sergiel I等人[21]利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對產(chǎn)自波蘭的不同蜂蜜中的多酚類化合物進(jìn)行分析，在椴樹蜜中發(fā)現(xiàn)橙皮素、阿魏酸、咖啡酸和香草酸，其中咖啡酸和香草酸這2種酚酸化合物的含量較低，而阿魏酸在椴樹蜜中的含量卻高于波蘭其他種類的蜂蜜，如洋槐蜜、蕎麥蜜、油菜蜜等。此外，Michalkiewicz A等人[22]在椴樹蜜樣品中鑒定出沒食子酸、對羥基苯甲酸、丁香酸、蘆丁、槲皮素等。Truchado P等人[23]指出，椴樹蜜中的短葉松素、松屬素、柯因和高良姜素具有相對更高的含量。Cetkovic Gordana等人[24]認(rèn)為，椴樹蜂蜜中最豐富的多酚類化合物是沒食子酸。Tomás-Barberán F A等人[25]研究歐洲椴樹蜜，僅鑒定出少量松屬素和短葉松素。因此，過去的研究顯示，在鑒定椴樹蜜中的多酚類化合物方面仍具有較大分歧，建立一種可靠、高效的能夠分析鑒定椴樹蜜中多酚類化合物的方法至關(guān)重要[26-27]。

通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析來自我國不同產(chǎn)地的椴樹蜜樣品，對其中的多酚類化合物進(jìn)行鑒定，并分別構(gòu)建紫椴蜜和糠椴蜜中多酚類化合物的高效液相指紋圖譜，進(jìn)而為我國椴樹蜜的品質(zhì)控制提供新的思路及方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同產(chǎn)地、不同時間采集的椴樹蜂蜜樣品共15份，其中紫椴蜜樣品7份，編號為樣品A，B，C，D，E，F(xiàn)，G；糠椴蜜樣品8份，編號為樣品H，I，J，K，L，M，N，O。采集后，將這些蜂蜜樣品置于4℃冰箱中保存。

椴樹蜜產(chǎn)地及時間樣品的信息見表1。

4-羥基苯甲酸、p-香豆酸、丁香酸甲酯、5-甲氧基短葉松素、肉桂酸、短葉松素、柯因、松屬素、山奈酚和短葉松素-3-乙酸酯，美國Sigma公司提供；順，反-脫落酸、反，反-脫落酸，成都生物技術(shù)有限公司提供；甲醇（色譜級）、乙酸（色譜級），美國Fisher公司提供；甲酸，國產(chǎn)分析純；超純水（ΜΩ·cm）。

表1 椴樹蜜產(chǎn)地及時間樣品的信息

1.2 儀器與設(shè)備

LC-6AD型高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；6540型四極桿飛行時間質(zhì)譜（Q-TOF MS）、7890A（GC-MS/MS）型氣相質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；固相萃取柱Strata-X-A（60 mg/3 mL），美國Phenomenex公司產(chǎn)品；超純水系統(tǒng)，美國Merk Millipore公司產(chǎn)品；24孔固相萃取裝置，美國Supelco公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 椴樹蜜樣品前處理

在孫春麗和Dimitrova B等人[28-29]研究方法的基礎(chǔ)之上進(jìn)行了改進(jìn)，具體操作流程如下：①固相萃取柱預(yù)處理，用4 mL甲醇對Strata-X-A SPE柱活化，再用4 mL超純水對其進(jìn)行平衡；②準(zhǔn)確稱取蜂蜜樣品30 g，溶于120 mL超純水中，攪拌至完全溶解，之后使用氨水將溶液調(diào)至pH值7；③將蜂蜜溶液以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，除去固體不溶物。然后取上清液倒入預(yù)先處理的固相萃取柱中；④上樣結(jié)束后，向萃取柱中加入4 mL超純水清洗，然后用5 mL甲醇（含5%甲酸）溶液進(jìn)行洗脫；⑤將洗脫液收集于試管中，通過氮吹儀（配有恒溫水浴鍋）將其干燥至恒質(zhì)量，然后于2 mL甲醇溶液中復(fù)溶，最后使用0.22μm濾膜（Millipore，Carrigtowhill，Cork，Ireland）過濾，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高效液相色譜質(zhì)譜分析條件

（1） 液相色譜條件。色譜柱250 mm×4.6 mm，5μm（Shim-Pack PREP-ODS），檢測波長280 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20μL，流動相：A相為水（含0.1%乙酸），B相為甲醇（含0.1%乙酸），總流速0.7 mL/min；梯度洗脫程序：0～11 min，9%～14%B；11～18 min，14%～20%B；18～22 min，20%～21%B；24～30 min，22%～25%B；30～35 min，25%～30%B；35～39 min，30%～32%B；39～43 min，32%～33%B；43～54 min，33%B；54～59 min，33%～34%B；59～69 min，34%～36%B；69～74 min，36%～40%B；74～79 min，40%～45%B；79～86 min，45%～52%B；86～94 min，52%～57%B；94～104 min，57%～65%B；104～109 min，65%～70%B；109～115 min，70%～75%B。

（2）液相質(zhì)譜條件。電噴霧離子化電離源（ESI），正離子、負(fù)離子雙模式檢測，離子源噴射電壓4 kV，出口電壓130 V，加熱溫度350℃，氮氣流速11 L/min，霧化器流速80 kPa，壓力40 psi，碰撞離子氣體為 氦氣，質(zhì)量掃描范圍為m/z=50～1 000，檢測波長280 nm，總流速0.5 mL/min。

1.3.3 氣相色譜質(zhì)譜分析條件

氣相色譜質(zhì)譜條件：HP-5型毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm），載氣為高純氦氣，流速45 cm/sec；柱初溫60℃，恒溫0.5 min后，以20℃/min升溫速率升溫至160℃，以8℃/min升溫速率升溫至175℃，以1.5℃/min升溫速率升溫至190℃，最后以9℃/min升溫速率升溫至280℃，保持5 min；分流比10∶1；掃描方式：SCAN；進(jìn)樣口溫度：250℃，進(jìn)樣量1μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 椴樹蜜中多酚類化合物的定性、定量分析

通過建立多種多酚類化合物的HPLC檢測方法，15個不同產(chǎn)地椴樹蜜的色譜圖如圖1所示，樣品A，B，C，D，E，F(xiàn)，G是紫椴蜜；樣品H，I，J，K，L，M，N，O是糠椴蜜。在這些椴樹蜜樣品中共鑒定出13種多酚類化合物，分別為4-羥基苯甲酸、p-香豆酸、丁香酸甲酯、反，反-脫落酸、順，反-脫落酸、肉桂酸、5-甲氧基短葉松素、短葉松素、山奈酚、松屬素、短葉松素-3-乙酸酯、柯因，其中3號峰代表的化合物是首次在我國椴樹蜜中發(fā)現(xiàn)，將其命名為椴樹素。所有椴樹蜜樣品的色譜圖大致相似，酚酸類物質(zhì)出峰時間集中于65 min之前，黃酮類及其酯類物質(zhì)集中于70 min之后出峰。但是，椴樹蜜樣品中化合物的種類和含量存在一定差異，紫椴蜜樣品中酚酸類物質(zhì)種類較多，黃酮類物質(zhì)種類較少，椴樹素含量最高；糠椴蜜樣品中多酚類化合物種類較齊全，順，反-脫落酸含量最高。

不同椴樹蜜樣品的HPLC色譜圖見圖1，椴樹蜜樣品中的多酚類化合物見表2。

圖1 不同椴樹蜜樣品的HPLC色譜圖

由于沒有椴樹素標(biāo)準(zhǔn)品，僅對其余鑒定出的多酚類化合物進(jìn)行定量分析。采用相同的HPLC色譜分析條件，繪制12種多酚類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品相對保留時間、紫外吸收光譜等，用外標(biāo)法統(tǒng)計分析各個椴樹蜜樣品中多酚類化合物的含量，結(jié)果如表2所示。在所有椴樹蜜樣品中，酚酸類物質(zhì)的平均含量為1 021.69μg/100 g，黃酮類物質(zhì)的平均含量為214.92μg/100 g。其中，脫落酸含量最高，順，反-脫落酸的平均含量達(dá)到250.17μg/100 g，是反，反-脫落酸含量的4倍。已有研究表明，椴樹蜜中含有一定數(shù)量的脫落酸，與該試驗研究結(jié)果具有一致性[19]。6種成分幾乎在所有椴樹蜜樣品中穩(wěn)定存在，包括p-香豆酸、反，反-脫落酸、順，反-脫落酸、肉桂酸、柯因和椴樹素，它們占總成分含量的80%左右。因此，初步推測p-香豆酸、反，反-脫落酸、順，反-脫落酸、肉桂酸、柯因以及椴樹素是我國椴樹蜜中主要的多酚類化合物。

表2 椴樹蜜樣品中多酚類化合物的含量/μg·（100 g）-1

此外，以往研究顯示，斯洛文尼亞的椴樹蜜中鑒定出木犀草素、槲皮素、柚皮素、芹菜素等[20]；波蘭的椴樹蜜中發(fā)現(xiàn)橙皮素、阿魏酸、咖啡酸、香草酸、對羥基苯甲酸和丁香酸等[21-24]；歐洲的椴樹蜜中僅鑒定出少量的松屬素和高良姜素等[25]。這些研究結(jié)果表明，不同區(qū)域的椴樹蜜中多酚類化合物的種類及含量存在很大差異。共鑒定出中國椴樹蜜中13種多酚類化合物，是目前從我國椴樹蜜中分離鑒定出多酚類化合物種類最多的報道。

2.2 椴樹素的鑒定

利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS） 方法測得3號峰化合物的質(zhì)荷比為165.090 85（M+H+），即可說明該化合物分子量為164，分子式為C10H12O2，計算不飽和度為5。

3號峰化合物液相質(zhì)譜圖（LC-ESI-MS）見圖2。

圖2 3號峰化合物液相質(zhì)譜圖（LC-ESI-MS）

由圖2可知，質(zhì)荷比為147.079 89是準(zhǔn)分子離子脫H2O后的二級產(chǎn)物，因此表明該化合物分子結(jié)構(gòu)中有1個氧原子是以羥基或羰基的形式存在。由質(zhì)荷比為119.085 70可以知道，其來自質(zhì)荷比為147.079 89的二級產(chǎn)物離子脫CO后的產(chǎn)物，以上分析得到高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)且驗證無誤。結(jié)合有機(jī)質(zhì)譜的裂解機(jī)理，分析該化合物分子結(jié)構(gòu)中的2個氧原子是以羧基的形式存在，然后通過GC-MS/MS分析檢出該組分，并結(jié)合圖譜對該組分進(jìn)行解析，如下：

3號峰化合物氣相質(zhì)譜圖（GC-EI-MS）見圖3。

圖3 3號峰化合物氣相質(zhì)譜圖（GC-EI-MS）

從GC-EI-MS圖譜中可看出（見圖3），在低質(zhì)量端有顯著的特征離子質(zhì)荷比為45（CHO2+），表明化合物分子結(jié)構(gòu)中存在羧基，進(jìn)一步驗證了LC-MS中的推論。GC-EI-MS圖譜中雖然存在質(zhì)荷比為39，質(zhì)荷比為51，質(zhì)荷比為77等苯環(huán)的特征離子，但是從其離子強度比例來看不符合苯環(huán)的裂解規(guī)律，所以確定該化合物分子結(jié)構(gòu)中不含苯環(huán)。此外，低質(zhì)量端的質(zhì)荷比為41，表明該化合物分子結(jié)構(gòu)中含有烯鍵，特征離子質(zhì)荷比為79表明該化合物分子結(jié)構(gòu)中含有脂肪環(huán)，而特征離子質(zhì)荷比為45示意羧基的存在，因此可以分析該化合物分子結(jié)構(gòu)中另外2個不飽和度將以2個環(huán)、或2個烯鍵、或1個炔鍵、或1個環(huán)加1個烯鍵的方式存在。2個環(huán)存在只能是1個四元環(huán)和1個三元環(huán)，而三元環(huán)張力大不穩(wěn)定，予以排除；炔鍵在天然產(chǎn)物中很少見，且其所產(chǎn)生的特征離子質(zhì)荷比為39理論要比質(zhì)荷比為41顯著，所以予以排除。因此可以得到剩余的2個不飽和度為1個環(huán)加1個雙鍵或2個烯鍵，而根據(jù)碎片離子強度及該化合物的最大紫外吸收波長（λ=301 nm），可進(jìn)一步排除環(huán)加雙鍵的結(jié)構(gòu)，即確定另外2個不飽和度來自2個烯鍵。結(jié)合該化合物分子結(jié)構(gòu)中不包含苯環(huán)，所以確定另外2個雙鍵的存在形式是環(huán)上和環(huán)外共軛結(jié)構(gòu)。綜合以上分析及碎片離子歸屬，推測出3號峰化合物為4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸結(jié)構(gòu)式。

4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸結(jié)構(gòu)式見圖4，4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸在EI源下的質(zhì)譜裂解途徑見圖5，4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸在ESI源下的質(zhì)譜裂解途徑見圖6。

圖4 4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸結(jié)構(gòu)式

圖5 4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸在EI源下的質(zhì)譜裂解途徑

綜上所述，通過HPLC-MS及GC-MS/MS技術(shù)，鑒定出椴樹蜜中3號峰化合物為4-異丙烯基-1,3-環(huán)己二烯-1-羧酸，首次在我國椴樹蜜中被發(fā)現(xiàn)，因此將其命名為椴樹素。

圖6 4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸在ESI源下的質(zhì)譜裂解途徑

2.3 構(gòu)建紫椴蜜與糠椴蜜HPLC指紋圖譜

相似度評價是指通過形成的對照指紋圖譜與所選擇的樣品色譜圖之間進(jìn)行相似度匹配，從而對其評價[30-32]。近年來，該指標(biāo)因其可作為食品藥品質(zhì)量監(jiān)督的重要依據(jù)，被越來越多的研究者所重視[33]。將7個紫椴蜜的HPLC圖譜數(shù)據(jù)與8個糠椴蜜的HPLC圖譜數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版（2004） 軟件，各自自動生成不同樣品標(biāo)記號S1～S7和S1～S8。選定紫椴蜜樣品S1與糠椴蜜樣品S1為參照圖譜，自動生成標(biāo)記號R，采用多點校正方法以消除各色譜圖之間的保留時間誤差，從而建立紫椴蜜與糠椴蜜樣品的HPLC指紋圖譜。

紫椴蜜、糠椴蜜HPLC指紋圖譜見圖7，紫椴蜜樣品指紋圖譜相似度見表3，糠椴蜜樣品指紋圖譜相似度見表4。

圖7 紫椴蜜、糠椴蜜HPLC指紋圖譜

表3 紫椴蜜樣品指紋圖譜相似度

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版軟件分別提取紫椴蜜樣品與糠椴蜜樣品色譜峰面積的數(shù)據(jù)，篩選色譜峰面積大于800 nA·min的色譜峰作為2種蜂蜜樣品的共有峰。根據(jù)對比共有峰的保留時間和紫外吸收光譜等，最終確定6個指標(biāo)峰的成分，分別為p-香豆酸、椴樹素、反，反-脫落酸、

表4 糠椴蜜樣品指紋圖譜相似度

順，反-脫落酸、肉桂酸和柯因。通過對2種不同蜂蜜樣品共有峰面積數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)紫椴蜜樣品中椴樹素與順，反-脫落酸之間的峰高比值為1.6～6.8，糠椴蜜樣品中椴樹素與順，反-脫落酸之間的峰高比值為0.24～0.50，說明紫椴蜜與糠椴蜜的HPLC指紋圖譜具有一定差異。此外，由表3和表4可知，紫椴蜜樣品的相似度范圍為0.751～0.968，糠椴蜜樣品的相似度范圍為0.804～0.961。其中，50%以上樣品的相似度高于0.9，說明花源相同的蜂蜜樣品中多酚類化合物的HPLC指紋圖譜相似度較高。因此，通過中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版軟件分別建立的紫椴蜜與糠椴蜜中多酚類化合物的HPLC指紋圖譜，可以成功地區(qū)分紫椴蜜與糠椴蜜。同時，結(jié)合以上椴樹蜜中多酚類化合物的分析鑒定，初步推測椴樹素和順，反-脫落酸可作為鑒定我國椴樹蜜的特征性指紋成分。但是，考慮到試驗中蜂蜜樣品數(shù)量及地理源有限等因素，應(yīng)用HPLC指紋圖譜區(qū)分紫椴蜜與糠椴蜜的研究還需更深一步的研究探討。

3 結(jié)論

蜂蜜的花源不同，其多酚類化合物的種類及含量也會存在一定差異。通過HPLC-MS和GC-MS對我國椴樹蜜中多酚類化合物進(jìn)行研究，共鑒定出13種多酚類化合物，并使用外標(biāo)法對其進(jìn)行了定量分析。其中，4-異丙基-1,3-環(huán)己二烯酸為首次在我國椴樹蜜發(fā)現(xiàn)，并將其命名為椴樹素。通過椴樹素和順，反-脫落酸峰高比值及多酚類成分的高效液相指紋圖譜，可實現(xiàn)紫椴蜜和糠椴蜜的明確區(qū)分，可為我國商品椴樹蜜的質(zhì)量評價提供一定的理論參考。