趙 娜 趙歆伊 孟 琦 邱雯賢 何 濱 馬小龍 張艷淑 姚 林, 李 爽

(1.華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，唐山 063210)(2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，唐山 063210)(3.華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，唐山 063210)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行關(guān)系非常密切，我國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》(GB 14922.2—2011)規(guī)定無(wú)特定病原體(Specific pathogen Free，SPF)級(jí)別小鼠須排除11種病毒，但仍會(huì)因動(dòng)物本身攜帶其他病原微生物而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。據(jù)報(bào)道，小鼠諾如病毒(Murine Norovirus，MNV)已經(jīng)成為目前實(shí)驗(yàn)小鼠感染率較高的一種病毒，免疫缺陷小鼠感染后發(fā)生炎癥反應(yīng)甚至死亡[1]，對(duì)科研工作危害極大[2-3]。本文就小鼠諾如病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)及其復(fù)制進(jìn)行綜述。

1 小鼠諾如病毒的分子生物學(xué)特點(diǎn)

1.1 基因組

小鼠諾如病毒屬于嵌杯狀病毒科(Caliciviride)諾如病毒屬(Norivirus)，與人源諾如病毒(Norwalk virus，NoV)的生物學(xué)及遺傳特性相似。MNV基因組長(zhǎng)約7.5 kb，為正義單鏈RNA，在其5′末端基因組和亞基因組RNA與病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5或病毒的末端結(jié)合蛋白(Viral protein genome-linked，VPg)共價(jià)連接，而3′末端為polyA結(jié)構(gòu)[4]?；蚪M由三個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)組成。之后有學(xué)者在ORF2內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ORF4，其被認(rèn)為編碼毒力因子[5]。ORF1編碼6個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(5′-NS1-2-NS3-NS4-NS5-NS6-NS7-3′)，其翻譯成的一個(gè)多聚蛋白被蛋白酶NS6切割產(chǎn)生成熟的與復(fù)制相關(guān)的病毒蛋白。ORF2和ORF3分別編碼衣殼蛋白(Capsid protein，VP1和2)，VP1和VP2是組成病毒粒子的結(jié)構(gòu)蛋白。ORF4編碼的毒力因子-1(Virulence factor-1，VF1)在感染小鼠中發(fā)揮重要作用，然而該蛋白在其他諾如病毒中未被發(fā)現(xiàn)。

1.2 病毒蛋白

1.2.1非結(jié)構(gòu)蛋白

目前，MNV的許多單個(gè)蛋白的功能尚未被闡明，它們的作用通常是根據(jù)保守的基序和已知的亞細(xì)胞定位從相關(guān)的病毒和序列分析數(shù)據(jù)推斷的，但肯定的是這些蛋白質(zhì)與其他正義單鏈RNA病毒編碼的蛋白質(zhì)一樣為多功能蛋白質(zhì)。

盡管NS1-2的功能尚不明確，但是轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum，ER)和高爾基體，可能參與了高爾基體的分解[6]。研究發(fā)現(xiàn)NS1-2影響細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的運(yùn)輸和表達(dá)，Ettayebi和Hardy的研究證明NS1-2能夠阻止水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)G-糖蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)，提示NS1-2可能具有潛在的免疫逃避作用。NS1-2可通過(guò)與囊泡相關(guān)膜蛋白A(Vesicle-associated membrane protein A，VAP-A)和分泌途徑的其他組分的相互作用破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)哪芰7]。ER和高爾基體的重排被認(rèn)為有助于募集宿主膜和蛋白質(zhì)以促進(jìn)病毒復(fù)制復(fù)合物(Replication complex，RC)的形成，有利于病毒復(fù)制[8]。在病毒感染過(guò)程中觀察到MNV NS1-2在RC內(nèi)的ER和dsRNA定位，表明NS1-2是RC的重要組成部分[9]。

NS3為2C樣蛋白，與小核衣殼蛋白家族的2C蛋白具有序列同源性和相似的基序，其包括核苷三磷酸酶(NTPase)基序，因此提示NS3可具有NTPase功能。Pfister等[10]發(fā)現(xiàn)NS3可以在體外與三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合，但是不具有解開(kāi)合成的DNA-RNA異源雙鏈的能力，因此顯示它不具有解旋酶活性。盡管在感染期間這些結(jié)構(gòu)還未被觀察到，但已經(jīng)證明單獨(dú)的MNV NS3蛋白表達(dá)形成水泡狀結(jié)構(gòu)并引起細(xì)胞內(nèi)膜的變化[6]。

通過(guò)對(duì)NS4內(nèi)部疏水性區(qū)域的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，它能與膜C-末端結(jié)合，被認(rèn)為是定位在ER的p30類(lèi)似物[10]。與NS4類(lèi)似的脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)3 A蛋白可以通過(guò)抑制ER-高爾基細(xì)胞運(yùn)輸引起免疫逃避[11]。研究發(fā)現(xiàn)MNV NS4轉(zhuǎn)染細(xì)胞后定位于ER和高爾基膜，且與NS5能相互作用[12]。

NS5在病毒轉(zhuǎn)錄、翻譯和衣殼化中具有重要作用。與小核糖核酸病毒(Picornavirus)和杯狀病毒科成員相似，gRNA和sgRNA都與5′端的帽結(jié)合蛋白(Cap-binding protein)類(lèi)似物NS5/VPg連接[13]。NS5/VPg的消耗或抑制的研究揭示其在翻譯復(fù)合物的募集以及翻譯起始中具有主要作用，結(jié)構(gòu)解析研究已經(jīng)顯示VPg形成具有靈活的N端/C端的螺旋核心，這對(duì)蛋白質(zhì)功能的多樣性十分重要[14]。研究顯示MNV VPg能夠結(jié)合翻譯起始因子eIF3和eIF4G1，進(jìn)一步說(shuō)明NS5在翻譯起始復(fù)合體中的作用[15]。

NS6是病毒編碼的半胱氨酸蛋白酶，可將ORF多聚蛋白切割成單獨(dú)的蛋白質(zhì)和一些中間產(chǎn)物(包括NS6-7前體)。NS6和中間產(chǎn)物NS6-7可以?xún)?yōu)先在不同位點(diǎn)裂解ORF1[16]。與其他RNA蛋白酶類(lèi)似，NS6以順式和反式切割多聚蛋白以產(chǎn)生多聚蛋白和成熟的單個(gè)NS蛋白[17]。在包括MNV在內(nèi)的杯狀病毒科成員中，ORF1內(nèi)的5個(gè)切割位點(diǎn)已被確認(rèn)為保守的切割位點(diǎn)[9]。在病毒感染期間，NS6主要定位于RC；當(dāng)單獨(dú)表達(dá)時(shí)，NS6顯示定位于線粒體[6]，其功能可能與丙型肝炎病毒(HCV)和甲型肝炎病毒(HAV)蛋白酶相似，可以通過(guò)切割線粒體抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)蛋白(Mitochondrial antiviral signalling protein，MAVS)抑制抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)[18]。

在大多數(shù)情況下，病毒感染細(xì)胞中NS6-NS7前體蛋白被進(jìn)一步加工產(chǎn)生病毒RNA依賴(lài)性的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)NS7。NS7催化基因組和亞基因組的正反義RNA轉(zhuǎn)錄。NS7和NS6-7前體蛋白在復(fù)制過(guò)程中已經(jīng)被證明具有生物學(xué)活性，在復(fù)制周期中的不同時(shí)間點(diǎn)，它們都可能發(fā)揮著更重要的作用[19]。NS7的晶體結(jié)構(gòu)顯示其不同條件下可表現(xiàn)出不同的酶活性[20]。

1.2.2結(jié)構(gòu)蛋白

VP1是病毒主要的衣殼蛋白(58～60 kDa)。VP1由N端臂，衣殼域(Shell domain，S)和突變域(Protruding domain，P)組成，形成“杯狀”結(jié)構(gòu)。S和P通過(guò)一個(gè)靈活的鉸鏈區(qū)域連接。病毒粒子需要衣殼蛋白的180個(gè)分子形成38 nm的衣殼，其顯示為T(mén)=3的二十面體對(duì)稱(chēng)[21]。

ORF3編碼的VP2是一種小的堿性蛋白，與病毒粒子成熟相關(guān)。VP2具有高度可變性，盡管關(guān)于其在復(fù)制中的作用知之甚少，但發(fā)現(xiàn)VP2在VP1表達(dá)和基因組的調(diào)節(jié)中起一定作用。研究顯示盡管VP2對(duì)VLP組裝是非必需的，但是對(duì)VLP的穩(wěn)定性有一定影響。與VP1相比，VP2的翻譯速度慢且效率低，每個(gè)病毒粒子中僅存在1～2個(gè)VP2拷貝，而VP1有180個(gè)拷貝[22]。

2 小鼠諾如病毒的復(fù)制

病毒基因組復(fù)制必須借助宿主翻譯機(jī)制翻譯病毒非結(jié)構(gòu)蛋白，特別是RNA依賴(lài)性RNA聚合酶(NS7)和蛋白酶(NS6)。基因組RNA作為非結(jié)構(gòu)蛋白的初始翻譯模板，而結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VF1分別主要是從亞基因組RNA中翻譯[4]。

同正義單鏈RNA病毒一樣，MNV基因組復(fù)制依賴(lài)于產(chǎn)生的反義中間體作為正義基因組RNA的模板。正義或反義的基因組和亞基因組RNA復(fù)制的啟動(dòng)具有VPg依賴(lài)性。正義基因組RNA合成是由VPg啟動(dòng)通過(guò)病毒RdRp(NS7)進(jìn)行合成的，VPg同時(shí)為反義模板3′末端的蛋白質(zhì)引物。RdRp通過(guò)MNV中保守的酪氨酸殘基(Y26)將VPg共價(jià)結(jié)合到基因組和亞基因組RNA的負(fù)義模板鏈的起始核苷酸上[23]。亞基因組RNA與最后2.4 kb的基因組RNA相同，與VPg和ployA連接。目前認(rèn)為啟動(dòng)亞基因組RNA合成的機(jī)制有兩種，分別是提前終止和內(nèi)部啟動(dòng)。亞基因組RNA的啟動(dòng)子由高度保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成，位于NS7編碼區(qū)VP1的上游。Lin等[24]發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子以及一個(gè)短模板序列優(yōu)先被MNV的RdRp識(shí)別，并確保能與RdRp穩(wěn)定結(jié)合。MNV VPg已經(jīng)被證實(shí)與翻譯復(fù)合物的組分相互作用，如eIF4F，eIF3和帽結(jié)合蛋白，其中eIF4F在VPg啟動(dòng)病毒蛋白翻譯中的作用尤為重要[13]。VPg和eIF4G的C-末端之間的相互作用是高效翻譯所需要的，另外VPg和eIF4F核心組分構(gòu)成的Poly A結(jié)合蛋白(Poly-(A)-binding protein，PABP)在MNV復(fù)制中發(fā)揮重要作用。

此外，位于ORF編碼區(qū)側(cè)翼的非編碼區(qū)(Untranslated regions，UTR)可能是通過(guò)與翻譯調(diào)控相關(guān)的宿主蛋白(包括La，PTB和DDX3)相互作用進(jìn)行基因組RNA翻譯。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)UTR與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用被抑制時(shí)病毒復(fù)制減少。這種相互作用被認(rèn)為通過(guò)促進(jìn)病毒RNA環(huán)化來(lái)誘導(dǎo)5‘和3’末端UTR上互補(bǔ)序列的結(jié)合來(lái)促進(jìn)病毒復(fù)制[25]。

一旦募集到宿主細(xì)胞翻譯復(fù)合物，MNV的非結(jié)構(gòu)蛋白被翻譯成單個(gè)多聚蛋白，進(jìn)一步被病毒蛋白酶NS6切割成單獨(dú)的NS蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，MNV的蛋白酶具有保守的殘基H30和C139，這些保守的氨基酸殘基對(duì)維持蛋白酶活性必不可少。May等[26]發(fā)現(xiàn)NS6在不同的切割位點(diǎn)的切割效率不同，導(dǎo)致NS2-3和NS3-4的切割速率高于NS4-5，NS5-6和NS6-7。最近發(fā)現(xiàn)裂解位點(diǎn)上游的殘基P4-P2′是一個(gè)重要的切割信號(hào)，負(fù)責(zé)控制酶的效率，從而導(dǎo)致有偏向性的切割。病毒RdRp在內(nèi)的非結(jié)構(gòu)蛋白在成功翻譯和加工后，含有所有NS蛋白以及VP1和VP2的病毒RC在宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中形成。MNV RC為點(diǎn)狀灶，定位于微管組織中心(Microtubule organizing center，MTOC)。其中VP1與乙?；⒐艿鞍坠捕ㄎ?，表明細(xì)胞骨架可能參與細(xì)胞內(nèi)RC的定位。RC與感染后形成的宿主細(xì)胞膜復(fù)合物和病毒誘導(dǎo)的膜囊泡相關(guān)，這些膜結(jié)構(gòu)可能從宿主細(xì)胞的ER和高爾基體衍生而來(lái)，并被重新分配到RC[27]。研究發(fā)現(xiàn)，MNV的NS1-2和NS4在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)時(shí)直接影響高爾基體和蛋白質(zhì)分泌，兩者共定位于ER和高爾基體，表明其在宿主的膜表達(dá)及再分配中發(fā)揮一定的作用[6]。