鄧仕華，胡章勇，吳東明，劉 騰，許 穎

成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗科(成都 610500)

肺癌作為最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率、病死率都高居所有惡性腫瘤之首，分別占11.6%和18.4%[1]。臨床上肺癌又分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小細(xì)胞肺癌，其中NSCLC約占85%。目前，盡管臨床上對肺癌的治療已經(jīng)取得了十足的進(jìn)展，但肺癌的預(yù)后仍不如人意。肺癌早期臨床癥狀不明顯，導(dǎo)致肺癌患者預(yù)后不良的主要原因是肺癌晚期時腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，且缺乏有效的治療措施。

目前關(guān)于肺癌轉(zhuǎn)移的具體分子機(jī)制尚未完全闡明。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的主要過程之一，常常受到多種基因的調(diào)節(jié)。在正常組織中，EMT與器官的發(fā)育、形成、組織的重塑和傷口的愈合有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中，極化的、遷移能力差的上皮細(xì)胞獲得高度惡性細(xì)胞的特征，特別是運動性、侵襲性和傳播能力[2]。EMT促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲的作用是基于間質(zhì)標(biāo)志物的富集(如N-cadherin)和上皮細(xì)胞標(biāo)志物的減少(如E-cadherin)[3]而實現(xiàn)。近年研究[4-5]表明，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)與包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。核仁小分子RNA宿主基因1(small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1)是一個LncRNA，在人體組織中廣泛表達(dá)，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展均有一定關(guān)系。已有研究[6-7]表明，SNHG1可通過調(diào)控微小RNA(microRNA)而間接促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性化進(jìn)展，但具體機(jī)制仍未有統(tǒng)一定論。因此，本研究在此基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步探討 SNHG1 在NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲和中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549及SPC-A1為本課題組保存。用于蛋白質(zhì)印跡法相關(guān)一抗：β-actin；E-cadherin，N-cadherin，Vimentin及二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(中國Proteintech公司)。本實驗所用的細(xì)胞培養(yǎng)皿、6孔板、24孔板、transwell小室等均購自康寧公司。qRT-PCR所用RNA提取試劑盒購于北京索萊寶生物公司。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒購于美國Bio-rad公司。ECL顯影液購于美國Millipore公司，化學(xué)發(fā)光成像儀購于美國Bio-rad公司。細(xì)胞培養(yǎng)用小牛血清購于中國Cell max公司，青-鏈霉素購于美國Gbico公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶購于美國hyclone公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549及SPC-A1細(xì)胞用含有10%的小牛血清及雙抗(100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱，待細(xì)胞密度達(dá)到約80%時，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 過表達(dá)質(zhì)粒由上海吉滿生物公司構(gòu)建并合成，干擾套裝由廣州銳博生物公司設(shè)計提供。轉(zhuǎn)染前接種2×105個細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞生長到80%時棄去原有培養(yǎng)基，更換為無血清新鮮培養(yǎng)基，1 750 μL/孔，取兩支1.5 mL EP管，分別加入125 μL無血清培養(yǎng)基再分別加入Lipo 3000 5 μL充分混勻。另取兩支1.5 mL EP管，分別加入125 μL 無血清培養(yǎng)基再分別添加SNHG1質(zhì)?；蛘吒蓴_序列2 μg，充分混勻后分別加入4 μL P3000(干擾序列不加)再次混勻。將用稀釋的質(zhì)?；蚋蓴_序列分別加入到已稀釋的Lipo 3000中，充分混勻后室溫靜置5 min。最后將250 μL混合液分別加入到6孔板中，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 h后更換含10%小牛血清的新鮮培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)需要收集細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.3 實時熒光定量PCR(qRT-PCR) 采用索萊寶總RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA的提?。籅io-rad逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；利用Bio-rad的 SYBR-Green PCR Mix試劑盒檢測 SNHG1 mRNA 表達(dá)水平。β-actin 作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt公式對SNHG1基因表達(dá)進(jìn)行相關(guān)計算。每組試驗重復(fù) 3 次。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 RIPA裂解細(xì)胞，BCA試劑盒(上海碧云天)檢測蛋白濃度，取60 μg蛋白用于上樣，用10%的SDS page膠跑電泳(濃縮膠80 V，分離膠120 V)，0.2 μmol/L的PVDF膜(美國Millipore)100 V轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜。次日TBST洗10 min 3次，加入二抗(1∶10 000)室溫孵育2 h，TBST洗10 min 3次，ECL顯影液顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。實驗重復(fù)3 次。

1.2.5 劃痕實驗 每6孔板孔中加10×104個各實驗組細(xì)胞，待細(xì)胞融合90%左右時用200 μL槍頭垂直6孔板劃橫線，生理鹽水洗3次，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按0、24 h的時間點拍照。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 transwell遷移及侵襲實驗 2×104個細(xì)胞加入含有200 μL無血清的培養(yǎng)基的transwell小室(小孔直徑8 μm)，24孔板孔中加入含有10%小牛血清的培養(yǎng)基600 μL，將transwell小室置于24孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室，PBS洗3次，用含1%的結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗3次，用棉簽擦去小室上層細(xì)胞，取下底膜，用中性樹膠封片，高倍鏡下計數(shù)5個視野，取平均值，以檢測細(xì)胞的遷移能力。細(xì)胞侵襲實驗與遷移大致相同，只是在加入細(xì)胞前有鋪基質(zhì)膠的過程：基質(zhì)膠matrigel 4 ℃解凍，按無血清培養(yǎng)基：matrigel=7∶1的比例混勻作為基質(zhì)膠層，每小室加入50 μL，待膠凝固(37 ℃ 1 h左右)，之后按遷移的步驟進(jìn)行后續(xù)實驗。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SNHG1在肺癌中存在高表達(dá)且與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)

利用GEO數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)集(GSE19804,GSE19188,GSE74706) 資料分析發(fā)現(xiàn)，SNHG1在肺癌組織中明顯高表達(dá)；在肺癌患者中SNHG1的表達(dá)量與總生存期存在負(fù)相關(guān)(GSE30219，P<0.001; GSE19188,P=0.034; GSE37745,P=0.011)(圖1)。

圖1 SNHG1在肺癌中存在高表達(dá)且與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)

注：A：3個GEO數(shù)據(jù)集分析顯示，SNHG1在腫瘤組織中的表達(dá)均高于正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.001；B：3個GEO數(shù)據(jù)集分析顯示，SNHG1的表達(dá)與患者的總生存期呈負(fù)相關(guān)

2.2 過表達(dá)SNHG1促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲及EMT

采用 qRT-PCR方法對SNHG1的過表達(dá)效率進(jìn)行了驗證,結(jié)果顯示A549細(xì)胞及SPC-A1細(xì)胞均發(fā)生了明顯的過表達(dá)，細(xì)胞劃痕結(jié)果顯示，劃痕愈合率A549過表達(dá)組為(73.67±6.50)%，對照組為(43.00±5.56)%，P=0.003；SPC-A1過表組為(63.67±5.51)%對照組為(43.31±6.96)%，P=0.012；transwell遷移實驗結(jié)果顯示，遷移細(xì)胞數(shù)A549過表達(dá)組為61.67±5.68，對照組為37.33±8.02，P=0.012；SPC-A1過表組為71.33±5.13對照組為43.33±7.02，P=0.005。劃痕及遷移實驗均表明，SNHG1明顯促進(jìn)了NSCLC細(xì)胞遷移；transwell侵襲實驗表明，SNHG1明顯提高了NSCLC細(xì)胞的侵襲能力(A549細(xì)胞侵襲數(shù)量為過表達(dá)組為46.00±7.50，對照組為29.00±5.65；P=0.035；SPC-A1過表組為75.00±8.00對照組為44.61±8.50，P=0.011)。利用蛋白質(zhì)印跡法檢測過表達(dá)SNHG1及對照組NSCLC細(xì)胞的上皮及間質(zhì)標(biāo)志物，結(jié)果表明，與空載組相比，過表達(dá)SNHG1的細(xì)胞上皮標(biāo)志蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)明顯減少，而間質(zhì)標(biāo)志蛋白N-鈣黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(vimentin)明顯增加，提示過表達(dá)SNHG1后腫瘤細(xì)胞發(fā)生了明顯的EMT(圖2)。

圖2 過表達(dá)SNHG1促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲及EMT

注：A: qRT-PCR檢測過表達(dá)質(zhì)粒SNHG1在A549及SPC-A1兩種NSCLC細(xì)胞中的表達(dá)效率，與空載組相比，***P<0.001；B、C：劃痕實驗檢測過表達(dá)SNHG1對NSCLC細(xì)胞遷移的影響，B：光鏡圖片，標(biāo)尺:500 m；C：統(tǒng)計圖，與空載組相比，*P<0.05，**P<0.001；D、E：transwell遷移實驗檢測過表達(dá)SNHG1對NSCLC細(xì)胞遷移的影響；D：結(jié)晶紫染色光鏡圖片，標(biāo)尺:50 m；E：統(tǒng)計圖，與空載組相比，*P<0.05，**P<0.001；F、G：transwell侵襲實驗檢測過表達(dá)SNHG1對NSCLC細(xì)胞侵襲能力的影響，F(xiàn)：結(jié)晶紫染色光鏡圖片，標(biāo)尺:50 μm；G：統(tǒng)計圖，與空載組相比，*P<0.05；H：蛋白質(zhì)印跡法檢測過表達(dá)SNHG1對NSCLC細(xì)胞EMT的影響

2.3 干擾 SNHG1抑制NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲及EMT

為了進(jìn)一步驗證SNHG1在NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲及EMT中的作用，本研究設(shè)計了SNHG1的干擾序列，利用qRT-PCR對SNHG1的干擾效率進(jìn)行了驗證，同時細(xì)胞劃痕[A549對照組愈合率為(43.32±9.07)%，干擾組為(22.00±3.61)%，P=0.019；SPC-A1對照組為(42.89±7.40)%，干擾組為(15.00±5.00)%，P=0.005]、transwell遷移(A549對照遷移數(shù)量為45.67±7.02，干擾組為29.00±5.00，P=0.028；SPC-A1對照組為35.67±7.63，干擾組為18.67±5.50，P=0.035)及侵襲(A549對照侵襲數(shù)量為40.00±5.00，干擾組為23.67±4.50，P=0.013；SPC-A1對照組為45.33±7.09，干擾組為26.67±5.68，P=0.023)實驗結(jié)果顯示：與對照組相比SNHG1干擾的NSCLC細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯減弱。蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果也證實干擾 SNHG1可明顯抑制NSCLC細(xì)胞EMT的發(fā)生(圖3)。

圖3 干擾 SNHG1抑制NSCLC細(xì)胞遷移、侵襲及EMT

注：A: qRT-PCR檢測SNHG1干擾序列在A549及SPC-A1兩種NSCLC細(xì)胞中的干擾效率，與對照組相比，**P<0.01；B、C：劃痕實驗檢測干擾SNHG1對NSCLC細(xì)胞遷移的影響;B：光鏡圖片，標(biāo)尺:500 μm；C：統(tǒng)計圖，與空載組相比，**P<0.001；D、E：transwell遷移實驗檢測干擾SNHG1對NSCLC細(xì)胞遷移的影響；D：結(jié)晶紫染色光鏡圖片，標(biāo)尺:50 μm；E：統(tǒng)計圖，與空載組相比，*P<0.05；F、G：transwell侵襲實驗檢測干擾SNHG1對NSCLC細(xì)胞侵襲能力的影響；F：結(jié)晶紫染色光鏡圖片，標(biāo)尺:50 μm；G：統(tǒng)計圖，與空載組相比，*P<0.05；H：蛋白質(zhì)印跡法檢測干擾SNHG1對NSCLC細(xì)胞EMT的影響

3 討論

肺癌是人類癌癥相關(guān)死亡的主要原因，2018年全球新發(fā)肺癌病例約209萬，死亡病例數(shù)約達(dá)176萬[1]。雖然當(dāng)前肺癌的手術(shù)治療、放化療等主要方法不斷取得新的進(jìn)展，但腫瘤轉(zhuǎn)移仍然是肺癌患者預(yù)后不良的主要原因，總體5年生存率仍較低[8]。因此，探索新的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并研究其影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制顯得尤為重要。

近年研究[9-10]表明，LncRNA不僅可通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)重構(gòu)、組蛋白修飾、DNA甲基化等多種途徑而轉(zhuǎn)錄激活或干擾多種重要生命活動，還與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有研究[11]表明，異常表達(dá)的LncRNA在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等惡性生物學(xué)進(jìn)程中扮演著重要作用，LncRNA有望成為腫瘤治療的新靶點。SNHG1位于11號染色體的1區(qū)2帶上，其長度為1 134 bp[12]。近年研究表明，異常表達(dá)的SNHG1可通過負(fù)性調(diào)控多種miRNA而促進(jìn)食管癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等腫瘤的惡性化進(jìn)展，另一方面SNHG1也可直接作用于腫瘤相關(guān)信號通路調(diào)控胰腺癌、結(jié)腸癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展。而關(guān)于SNHG1在肺癌中的作用及具體的作用機(jī)制尚無統(tǒng)一定論，仍需進(jìn)一步研究。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫資料證實， SNHG1在肺癌組織中高表達(dá)，并分析了SNHG1的表達(dá)與肺癌患者的總生存期呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。并通過在兩種NSCLC細(xì)胞中過表達(dá)以及干擾SNHG1后，檢測NSCLC細(xì)胞的遷移、侵襲能力以及EMT的發(fā)生情況。

綜上所述，SNHG1可能通過促進(jìn)NSCLC細(xì)胞發(fā)生EMT而增加其遷移和侵襲能力，由此推斷SNHG1可能成為NSCLC治療的新靶點。