郝欣，王榮升，李建輝

(承德市中心醫(yī)院，河北承德067000)

幽門螺桿菌(Hp)具有高感染性，普通人群Hp感染率約為50%，是消化性潰瘍、遠(yuǎn)端胃腺癌和胃淋巴瘤的主要病因[1，2]。研究顯示，Hp可使活性氧過度積累從而導(dǎo)致組織細(xì)胞毒性損傷及再生障礙，促使胃部炎癥反應(yīng)持續(xù)存在和加??；通過促進(jìn)活性氧和氮的釋放，Hp可使脆性組氨酸三聯(lián)體表達(dá)下調(diào)和白細(xì)胞介素8表達(dá)上調(diào)，以促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展[3]。但是以上具體致病機(jī)制尚未完全明確。近年來，與Hp易感性有關(guān)的人類基因研究逐漸成為熱點(diǎn)。p53基因是重要的腫瘤抑制基因之一，是目前發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性較高的基因[4]。p53介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡與凋亡，在調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生命活動(dòng)中起重要作用。但是p53基因突變后會(huì)失去對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)的調(diào)控作用，由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?。p53基因失活突變與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。本研究探討Hp感染胃潰瘍患者p53基因第72密碼子基因多態(tài)性，進(jìn)一步闡明Hp感染胃潰瘍發(fā)病的遺傳學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2015年1月～2015年12月承德市中心醫(yī)院消化內(nèi)科診斷為Hp感染胃潰瘍患者150例(觀察組)，男89例、女61例，年齡(43.72±7.18)歲，病程(3.26±1.82)年；潰瘍部位：胃竇71例、胃角44例、胃體19例、胃底16例。同時(shí)選擇非Hp感染的150例胃潰瘍患者作為對(duì)照組，男84例、女66例，年齡(45.29±8.25)歲，病程(3.33±2.16)年；潰瘍部位：胃竇59例、胃角52例、胃體21例、胃底18例。兩組年齡、性別、病程、潰瘍部位等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。胃潰瘍以胃鏡檢查以及X線鋇餐檢查確診。胃鏡檢查時(shí)取活檢標(biāo)本進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)和組織學(xué)檢查，若兩種檢查結(jié)果均為陽性則判斷為Hp感染陽性，若兩種檢查結(jié)果均為陰性則判斷為Hp感染陰性。快速尿素酶試驗(yàn)和組織學(xué)檢查結(jié)果不一致的患者不納入研究。

1.2 Hp感染胃潰瘍的治療 Hp感染胃潰瘍患者采用三聯(lián)療法聯(lián)合胃黏膜保護(hù)劑進(jìn)行治療。三聯(lián)療法為埃索美拉唑20 mg+克拉霉素0.5 g+阿莫西林1.0 g，2次/d；胃黏膜保護(hù)劑為硫糖鋁片1 g，4次/d。療程為4周。停藥1個(gè)月后復(fù)查胃鏡，觀察胃潰瘍愈合情況及Hp根除情況。

1.3 p53基因第72密碼子基因型檢測(cè) 治療前取EDTA抗凝管分別收集兩組空腹外周靜脈血5 mL，采用北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司的RNApure Blood Kit提取p53基因第72密碼子DNA，以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性。采用美國Thermo 公司Nanodrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的純度和濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩53基因第72密碼子DVA的PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列：上游5′-AGAGGAATCCCAAAGTTCCA-3′，下游5′-AGAGGAATCCCAAAGTTCCA-3′，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為413 bp。PCR反應(yīng)總體系為10 μL：2 × Taq Man Master Mix 5.0 μL，P53基因引物各0.45 μL，Taq Man FAM和HEX 探針各0.25 μL，模板DNA 2.0 μL及去離子水1.6 μL。采用ABI 9700 PCR 儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性0.5 min，58 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸0.5 min，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸6 min。以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物并且以Gene Genius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(美國Syngene公司)進(jìn)行分析。PCR產(chǎn)物采用限制性內(nèi)切酶Bst UI進(jìn)行酶切，60 ℃水浴過夜。酶切總體系如下：酶切 Buffer 2 μL，p53 PCR產(chǎn)物4 μL，酶0.5 μL，無酶水13.5 μL，共20 μL。酶切產(chǎn)物10 μL經(jīng)2%瓊脂糖電泳40 min，用Gene Genius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。根據(jù)電泳結(jié)果酶切產(chǎn)物分為Pro/Pro基因型、Arg/Arg基因型和Pro/Arg基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；用Hardy-Weinberg檢驗(yàn)進(jìn)行基因型頻率吻合度檢測(cè)；用Logistic回歸分析p53基因第72密碼子基因多態(tài)性與Hp易感性的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p53基因第72密碼子基因多態(tài)性 p53基因第72密碼子基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在413 bp處出現(xiàn)目基因片段的電泳條帶，見圖1。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過Bst UI酶切后分別在160、253、413 bp處出現(xiàn)3種電泳條帶，其中在413 bp處出現(xiàn)1條電泳條帶的為Pro/Pro基因型，在253和160 bp處出現(xiàn)2條電泳條帶的為Arg/Arg基因型，而在453、253和160 bp處出現(xiàn)3條電泳條帶的為Pro/Arg基因型。見圖2。

注：M為DNA Ladder；1為陰性對(duì)照；2～10為p53基因第72密碼子基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖1p53基因第72密碼子基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

注：M為DNA Ladder；1 為陰性對(duì)照；2、3、7為Pro/Pro基因型；5、6、10為Arg/Arg基因型；4、8、9為Pro/Arg基因型。

圖2p53基因第72密碼子基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物酶切產(chǎn)物電泳圖

2.2 兩組p53基因第72密碼子基因型表達(dá)及其與Hp感染的關(guān)系 兩組p53基因第72密碼子Pro/Pro、Arg/Arg和Pro/Arg基因型頻率均符合Hardy-Weinber平衡定律(P>0.05)，說明各基因類型在兩種人群中的分布符合遺傳平衡，樣本具有群體代表性。兩組p53基因第72密碼子基因型Pro/Pro、Arg/Arg和Pro/Arg分布頻率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，與基因型為Arg/Arg和Pro/Arg比較，基因型Pro/Pro的胃潰瘍患者幽門螺旋桿菌感染危險(xiǎn)性升高(OR分別為0.586、0.512、1.000，P均<0.05)。

表1 兩組p53基因第72密碼子基因型比較[例(%)]

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 Hp感染胃潰瘍患者p53基因第72密碼子基因多態(tài)性與臨床預(yù)后的關(guān)系 藥物治療4周后停藥1個(gè)月時(shí)，觀察組Hp根除率和潰瘍愈合率分別為77.33%和83.33%。p53基因第72密碼子不同基因型患者Hp根除率和潰瘍愈合率差異具有統(tǒng)計(jì)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 p53基因第72密碼子不同基因型Hp感染胃潰瘍患者Hp根除和潰瘍愈合情況比較[例(%)]

3 討論

p53基因位于人類17號(hào)染色體短臂上，編碼一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為53 kD的核磷酸蛋白，具有轉(zhuǎn)錄因子的活性，在控制細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及DNA修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。p53基因是一種抑癌基因，p53介導(dǎo)細(xì)胞在DNA損傷后于G1期停滯進(jìn)行切除和修復(fù)，以保持基因組的穩(wěn)定性，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤最密切相關(guān)的基因。目前已發(fā)現(xiàn)p53基因多態(tài)性至少為10種，多項(xiàng)研究顯示位于第4外顯子的p53基因第72密碼子基因多態(tài)性與頭頸腫瘤、肝腫瘤等多種惡性腫瘤的易感性密切相關(guān)[6,7]。p53也參與免疫和代謝系統(tǒng)的多種功能，影響干細(xì)胞生成[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，p53組成的信號(hào)通路在胃黏膜損傷和修復(fù)過程中扮演著極為重要的角色。p53信號(hào)分子的異常表達(dá)，可造成黏膜細(xì)胞損傷，遷移受阻，凋亡加速，進(jìn)而破壞胃黏膜防御屏障，導(dǎo)致胃黏膜損傷發(fā)生。編碼p53基因第72位密碼子的氨基酸包括Arg和Pro，含Arg/Arg和Pro/Pro兩種基因類型的p53均為野生型，Arg/Pro為突變型。野生型和突變型的分子生物學(xué)行為和功能相差很大[9]。野生型p53具有負(fù)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的能力，可感知細(xì)胞基因組的完整性，修復(fù)損傷DNA，清除有癌變傾向的細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。在野生型p53中，Arg較Pro有更強(qiáng)的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力[11]。p53一旦發(fā)生突變，則失去抑癌功能，并誘導(dǎo)正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化，同時(shí)突變型p53阻礙其他野生型p53發(fā)揮功能，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、演進(jìn)及轉(zhuǎn)移[12]。有研究顯示，p53基因第72密碼子多態(tài)性可導(dǎo)致乳腺癌患者對(duì)化療及內(nèi)分泌治療反應(yīng)的不同，影響患者預(yù)后及生存[13]。

Hp是一種具有較高感染率的革蘭陰性致病菌，寄生于胃黏膜，目前已知其與慢性胃炎、胃和十二指腸潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織淋巴瘤和胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[14～18]。由Hp分泌的Cag A蛋白等毒性蛋白可激活核因子κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)各種炎癥介質(zhì)生成增加，導(dǎo)致胃黏膜炎癥、胃潰瘍的產(chǎn)生，甚至誘發(fā)胃黏膜發(fā)生癌變[19]；對(duì)胃潰瘍患者Hp易感基因的研究，可為建立胃癌高危人群預(yù)警和應(yīng)用分子標(biāo)志物早期診斷奠定基礎(chǔ)。本研究顯示，Hp感染陽性胃潰瘍患者p53基因第72密碼子基因型Pro/Pro、Arg/Arg、Pro/Arg與Hp感染陰性胃潰瘍患者比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與基因型為Arg/Arg和Pro/Arg的患者比較，基因型為Pro/Pro者Hp感染危險(xiǎn)性升高，Hp根除率和胃潰瘍愈合率降低。說明p53基因第72密碼子基因型Pro/Pro可增加胃潰瘍Hp感染的危險(xiǎn)并影響患者預(yù)后。