吳樂(lè)樂(lè)，葉功照，童巧瓊，王丹麗,2

(1.寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，寧波 315211；2.寧波大學(xué) 應(yīng)用海洋生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧波 315211)

蚤狀溞(Daphniapulex)是一種常見(jiàn)的淡水枝角類(lèi)，俗稱(chēng)紅蟲(chóng)，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)，甲殼綱(Crustacea)，雙甲目(Diplostraca)，廣泛分布于我國(guó)的淡水湖泊、河流中。蚤狀溞因其易繁殖、適應(yīng)性強(qiáng)、生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)仔量高、蛋白質(zhì)含量高、易培養(yǎng)等特點(diǎn)，成為許多水產(chǎn)動(dòng)物育苗中必不可少的關(guān)鍵活體餌料。近幾年來(lái)，隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃興起及苗種生產(chǎn)的不斷發(fā)展，對(duì)枝角類(lèi)的需求量越來(lái)越大，故深入研究蚤狀溞，有著重大的意義。在枝角類(lèi)的分子水平研究中，蚤狀溞是第一個(gè)基因組序列被測(cè)出來(lái)的溞類(lèi)[1]。

枝角類(lèi)生殖方式十分獨(dú)特，在環(huán)境適宜條件下，其主要以孤雌生殖(單性生殖)方式繁殖，雌體所產(chǎn)卵子不需受精而直接發(fā)育成子代；而當(dāng)其受到食物匱乏、溫度驟變、種群密度過(guò)大等環(huán)境因素脅迫時(shí)，雄性個(gè)體出現(xiàn)，進(jìn)而生殖方式轉(zhuǎn)變?yōu)閮尚陨砙2]。然而，本實(shí)驗(yàn)室在蚤狀溞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，即使保持穩(wěn)定的最適環(huán)境，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，溞體也會(huì)逐漸進(jìn)入衰老狀態(tài)，同時(shí)伴隨著更多的兩性溞和卵鞍的出現(xiàn)。這一現(xiàn)象與Fontana等[3]認(rèn)為衰老是隨著時(shí)間的推移，伴隨著分子、細(xì)胞和組織器官的損傷，生物體的機(jī)能和結(jié)構(gòu)逐漸衰退、老化的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，最終導(dǎo)致生物體死亡的觀點(diǎn)相一致。因此我們推測(cè)枝角類(lèi)進(jìn)行有性生殖主要是由內(nèi)部因素決定，環(huán)境變化僅在一定程度上起誘導(dǎo)作用，即在環(huán)境條件好的情況下隨著溞年齡的增長(zhǎng)，衰老進(jìn)程的發(fā)展，最后從量變發(fā)生了質(zhì)變，進(jìn)入兩性生殖模式。

Caspase(Cysteinylaspantate specific pnoteinase)半胱氨酸天門(mén)冬氨酸蛋白酶家族主要存在于動(dòng)物細(xì)胞中，參與細(xì)胞因子的成熟、衰老、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化調(diào)控，在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要的功能[4]。Caspase家族與真核細(xì)胞有著密切的聯(lián)系，無(wú)論是在低等的無(wú)脊椎動(dòng)物，還是高等的哺乳動(dòng)物中均高度保守，而在酵母和植物這類(lèi)沒(méi)有典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的生物中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，由此可見(jiàn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生很大程度上依賴(lài)于Caspase家族蛋白酶的活化。而Caspase-3是迄今為止在該家族中研究較為透徹，且起主要效用的一種蛋白，在凋亡的有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，Caspase-3處于下游，是多種凋亡刺激信號(hào)傳遞的匯聚點(diǎn)，通過(guò)信號(hào)觸發(fā)蛋白底物裂解，細(xì)胞解體，最終完成細(xì)胞凋亡[5]，可見(jiàn)Caspase-3是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，它的活化也是細(xì)胞進(jìn)入不可逆凋亡階段的標(biāo)志[6]。Caspase-3還可以激活促凋亡蛋白，拮抗抑凋亡蛋白[7]，破壞細(xì)胞平衡狀態(tài)及修復(fù)機(jī)制，加速細(xì)胞凋亡[8]。

已有許多研究表明Caspase-3的活性與年齡相關(guān)，隨著年齡增長(zhǎng)，C57B/6J小鼠大腦初級(jí)聽(tīng)皮層中caspase-3的表達(dá)增多，凋亡抑制蛋白XIAP的表達(dá)量減少[9]。胡艷麗等人的研究結(jié)果顯示在衰老模型動(dòng)物大腦海馬中，有大量caspase-3蛋白表達(dá)，且較對(duì)照組明顯增多[10]。Zhao等[1]和Su等[12]也提出caspase-3在衰老和阿爾茨海默病(AD)的某些特定腦區(qū)異常高表達(dá)。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)caspase-3基因受環(huán)境因子的影響很大，是一種環(huán)境敏感型基因，環(huán)境的變化會(huì)給予細(xì)胞一定的刺激，從而產(chǎn)生凋亡信號(hào)[13-14]。多因素方差分析顯示,養(yǎng)殖條件、溫度變化及變化時(shí)間、非離子氨濃度和脅迫時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)血淋巴和肝胰腺Caspase-3 活性均具有顯著影響(P<0.05)[14]。目前，caspase-3基因表達(dá)定量也被證實(shí)可用于測(cè)定細(xì)胞凋亡水平，表達(dá)量越高則細(xì)胞凋亡水平越高[13]。

本研究擬通過(guò)分析蚤狀溞caspase-3基因在不同溫度、種群密度和食物種類(lèi)下的表達(dá)水平差異，以及3種環(huán)境因子對(duì)Caspase-3酶活變化的影響，結(jié)合整體原位雜交檢測(cè)caspase-3基因在不同生殖狀態(tài)下的表達(dá)位點(diǎn)，初步探索蚤狀溞caspase-3基因在不同環(huán)境條件下的時(shí)空表達(dá)，為今后深入探究衰老相關(guān)的caspase-3基因是否參與調(diào)控枝角類(lèi)生殖模式轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制提供一定的理論參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料馴化與培養(yǎng)

試驗(yàn)所用的蚤狀溞是由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并培養(yǎng)保種的，成體體長(zhǎng)(3.0±0.3)mm。挑選其中健康并且活力較強(qiáng)的蚤狀溞，在玻璃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2～3 d添加“Banta糞土培養(yǎng)液”(1.5 g兔子糞，2 g新鮮稻草，20 g沃土和1 L水，煮沸冷卻取上清或過(guò)濾)進(jìn)行馴化，pH值控制在7.0～7.5的范圍內(nèi)，培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光周期為12 h光照和12 h黑暗，并且每3 d更換1/3體積的新鮮培養(yǎng)液。馴化完成后，在500 mL的玻璃燒杯進(jìn)行培養(yǎng)，每杯加入“Banta糞土培養(yǎng)液”500 mL，從馴化好的蚤狀溞中挑選出大量懷卵的蚤狀溞放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與之前相同。過(guò)1～2 d會(huì)有小溞出生，挑選同一批出生的小溞按實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 不同溫度下蚤狀溞的培養(yǎng)

在15℃、20℃、25℃、30℃和變溫(10℃～18℃)5組不同溫度下，每組用6個(gè)500 mL的燒杯培養(yǎng)蚤狀溞，每只燒杯接種150只活力好，且大小相似的同一天出生的蚤狀溞。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。其中3個(gè)燒杯溞用于測(cè)定Caspase-3酶活，另外3個(gè)燒杯溞用于測(cè)定caspase-3 mRNA表達(dá)量)。

1.3 不同密度下蚤狀溞的培養(yǎng)

設(shè)計(jì)5組不同密度，用500 mL的玻璃燒杯培養(yǎng)蚤狀溞，分別接種50、100、150、200 和300只活力好，且大小相近的同一天出生的蚤狀溞，培養(yǎng)液為“Banta糞土培養(yǎng)液”，溫度控制為23℃～25℃。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

1.4 不同食物投喂下蚤狀溞的培養(yǎng)

設(shè)計(jì)2組不同食物，用500 mL的燒杯培養(yǎng)蚤狀溞，每只燒杯接種150只活力好，且大小相似的同一天出生的蚤狀溞，分別用“Banta糞土培養(yǎng)液”和濃度為1×105～1×106cell/mL小球藻(Chlorellavulgaris)進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制為23℃～25℃。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行。

以上試驗(yàn)均培養(yǎng)8 d(絕大部分在第8天已經(jīng)性成熟，性成熟的標(biāo)志是懷卵)，pH值控制在7～8之間，每天觀察記錄溞的生長(zhǎng)情況，并剔除剛出生的小幼溞，在第4天時(shí)換1/3的培養(yǎng)液。

1.5 蚤狀溞總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成

各實(shí)驗(yàn)組收集不同培養(yǎng)條件下蚤狀溞樣品150～200只，去水稱(chēng)重。用RNA提取試劑盒(RNA Extraction Kit，Axygen)分別提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性。每組各取1 μg RNA，以上述提取的總RNA為模版，用HiFiscript cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，立即實(shí)驗(yàn)或-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 caspase-3基因熒光定量

以蚤狀溞不同模板的cDNA作為模板，用特異性引物CaspRT-F(CGTTGAAGATGTTTGGATGCC)/CaspRT- R(GATGAACAGGAGCCACTGC)和18S-F(GTGCGTCGTTGTTGTATCTGC)/18S-R(TCCATGCTGCGATATTCAGG)進(jìn)行熒光定量PCR。數(shù)據(jù)采集在LC480上完成，采用2-△△Ct法[15]進(jìn)行引物的效率檢測(cè)，若PCR產(chǎn)物的溶解曲線(xiàn)沒(méi)有雜峰，則顯示產(chǎn)物特異性好。

1.7 Caspase-3酶活的檢測(cè)

收集不同實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)條件下蚤狀溞樣品，裂解后離心獲得上清。根據(jù)Caspase-3試劑盒說(shuō)明書(shū)，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度A405下樣品數(shù)據(jù)，同時(shí)做空白對(duì)照。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)換算樣品催化產(chǎn)生pNA的量。酶活力=[吸光度A405值(2 h)-吸光度A405值(0 h)]/樣品重量(mg)/ 1.5×105

1.8 數(shù)據(jù)處理

1.9 caspase-3 RNA探針的制備

首先根據(jù)已獲得的caspase-3 cDNA全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào):KY622004)，設(shè)計(jì)合成探針的引物CaspPro-F(GATGAACAGGAGCCACTGC)/CaspPro-R(CTATTTCCTTGACAGCCACTG)，構(gòu)建pGEM-T-caspase-3重組質(zhì)粒。將pGEM-T-caspase-3重組質(zhì)粒酶切線(xiàn)性化，采用AxyPrep PCR純化試劑盒回收線(xiàn)性化的模板質(zhì)粒，用1.0%DEPG處理的去離子水中重懸于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將純化的線(xiàn)性化質(zhì)粒作為體外轉(zhuǎn)錄的 DNA 模板，參照DIG RNA Labeling Mix和Riboprobe?System—SP6/T7實(shí)驗(yàn)程序，體外轉(zhuǎn)錄合成 DIG 標(biāo)記的Caspase-3正反義RNA 探針。用無(wú)RNA酶活性的DNA酶處理除去DNA，然后加入2.5 μL的4 mol/L LiCl(DEPC水配制)和75 μL冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇，輕輕混勻后于-20℃放置過(guò)夜。再在4℃，12 000 r/min下離心30 min，棄上清。加入100 μL預(yù)冷的70%乙醇(DEPC 水配制)清洗沉淀，4℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清。向 RNA沉淀中加入30 μL RNase Free ddH2O和1.5 μL RNase inhibitor自然溶解，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)和濃度測(cè)定后，將其放置在-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.10 整體原位雜交檢測(cè)caspase-3基因的表達(dá)定位

取在-20℃脫水保存的孤雌成溞和在高溫和高密度實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)卵鞍的兩性雌溞，在梯度濃度甲醇中逐步復(fù)水至PBST，每次洗脫5 min。在含100%1 ×PBST中漂洗10 min洗脫2次。用含10 μg/mL蛋白酶K的PBST在37℃下消化15 min。然后在4%PFA中固定20 min，PBST漂洗2次。經(jīng)過(guò)1∶1預(yù)雜交液/PBST漂洗5 min，于68℃預(yù)雜交2 h(預(yù)雜交液∶RNA探針=1∶100，探針濃度約4 ng/μL)。預(yù)雜交液做空白對(duì)照，正義探針作陰性對(duì)照，反義RNA探針為實(shí)驗(yàn)組。70℃雜交過(guò)夜，不超過(guò)16 h。雜交后于72℃下，依次經(jīng)過(guò)50% 4×SSC+50%MABT洗20 min，50%2×SSC+50% MABT洗20 min，2×SSC洗20 min，0.2×SSC洗40 min 2次，0.5×PBST室溫洗20 min 2次。室溫下用封閉液(MAB Block)封閉2 h。用Anti-DIG單抗按1∶5000將抗體加入到封閉液中，4℃下過(guò)夜處理。經(jīng)過(guò)PBST漂洗8次，每次15 min。TSM1漂洗2次，每次20 min，TSM2漂洗2次，每次20 min。然后用NBT/BCIP室溫下避光染色10～20 min。

用1×PBST漂洗，放在4%PFA中，4℃保存。結(jié)果用顯微鏡進(jìn)行圖像采集，拍照記錄caspase-3基因在溞體中的表達(dá)定位情況。

2 結(jié)果

2.1 蚤狀溞存活率和生長(zhǎng)情況觀察

試驗(yàn)期間各實(shí)驗(yàn)組的存活概率都在95%以上。

溫度組：室溫組和15℃實(shí)驗(yàn)組蚤狀溞個(gè)體較小，且在8 d之內(nèi)只有懷卵情況而沒(méi)有小溞產(chǎn)生，其他各個(gè)實(shí)驗(yàn)組都有小溞產(chǎn)生。30℃組出現(xiàn)卵鞍。

密度組：200 ind/500 mL和300 ind/500 mL組的蚤狀溞幾乎都在杯底并擠成一團(tuán)只有個(gè)別溞在其他水層游動(dòng)，且密度越高蚤狀溞個(gè)體也越小。50 ind/500 mL組在第5天就有部分蚤狀溞生產(chǎn)，密度越高所產(chǎn)小溞越少。300 ind/500 mL組出現(xiàn)卵鞍。

食物組：第8天時(shí)以Banta培養(yǎng)液培養(yǎng)的蚤狀溞溞體明顯大于以小球藻培養(yǎng)的蚤狀溞，同時(shí)小球藻組只產(chǎn)生了較少的幼溞，而B(niǎo)anta培養(yǎng)液組生產(chǎn)的幼溞明顯較多。

2.2 蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同環(huán)境條件下的表達(dá)

根據(jù)測(cè)定的cDNA濃度值，選取10倍稀釋度進(jìn)行Real-Time PCR擴(kuò)增反應(yīng)，獲得相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，引物18S-F/R和CaspRT-F/R的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別如圖1和圖2所示。qPCR對(duì)擴(kuò)增引物的特異性要求高，從引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖中得到，caspase-3相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9986，18S(R2)為0.9976，越接近1可信度越高；標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率分別為-3.48和-3.60，將其換算為引物的擴(kuò)增效率(E)分別為1.05和1.08，越接近1越理想；兩者的擴(kuò)增效率應(yīng)保持一致。R2、E及曲線(xiàn)斜率均在正常范圍內(nèi)，所以可拿來(lái)當(dāng)實(shí)時(shí)熒光定量的引物。

圖1 目的引物caspase-3和參照18S的擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖Figure 1 Standard curves of target primer caspase-3 and 18S reference amplification

圖2實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)圖Figure 2 Real time fluorescence quantitative detection map

2.2.1 蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同溫度下的表達(dá)

利用qPCR相對(duì)定量方法分析了蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同溫度下蚤狀溞體內(nèi)的表達(dá)，基因的表達(dá)特征圖譜，見(jiàn)圖3-a、b所示表達(dá)電泳規(guī)律一致。caspase-3在30℃時(shí)的表達(dá)量最高，高于其他生長(zhǎng)階段(P<0.05)，總體上caspase-3的mRNA表達(dá)量隨著溫度的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，室溫組的表達(dá)量則介于20℃組與25℃組之間。

2.2.2 蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同種群密度下的表達(dá)

從圖4可以看出，caspase-3 mRNA的表達(dá)量隨著密度的上升總體是呈上升的趨勢(shì)(P<0.05)，在100 ind/500 mL的時(shí)caspase-3 mRNA的表達(dá)量為最低。

圖3 蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同溫度下的電泳圖和表達(dá)情況Figure 3 Electrophores(a) and expression(b) of caspase-3 mRNA in D.pulex at different temperatures

注：圖中不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)；下同

圖4 蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同密度下的表達(dá)情況Figure 4 Expression of caspase-3 mRNA in D.pulex under different densities

2.2.3 蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同食物下的表達(dá)

從圖5可以看出，在本實(shí)驗(yàn)中“Banta糞土培養(yǎng)液”組caspase-3 mRNA的表達(dá)量低于小球藻組，但無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖5 蚤狀溞caspase-3 mRNA在不同食物下的表達(dá)情況Figure 5 Expression of caspase-3 mRNA in D.pulex with different food specoes

2.3 蚤狀溞Caspase-3酶活性在不同環(huán)境因子中的變化

2.3.1 蚤狀溞Caspase-3酶活性在不同溫度下的變化

為進(jìn)一步研究蚤狀溞Caspase-3蛋白酶在蚤狀溞體內(nèi)的表達(dá)情況，對(duì)Caspase-3的酶活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖6。可以看出蚤狀溞在15℃～20℃時(shí)Caspase-3酶活性較低，并在15℃時(shí)Caspase-3的酶活性最低為12.63 nmol/mg/h，30℃時(shí)最高為83.97 nmol/mg/h。除變溫組總體隨著溫度的升高蚤狀溞Caspase-3的酶活性也隨之顯著升高(P<0.05)。與caspase-3 mRNA在不同溫度下的表達(dá)趨勢(shì)一致。

圖6 蚤狀溞Caspase-3的酶活性在不同溫度下的變化Figure 6 Changes of enzyme activity of Caspase-3 in D.pulex at different temperature

2.3.2 蚤狀溞Caspase-3酶活性在不同密度下的變化

從圖7可以看出，蚤狀溞在密度為50～150 ind/500 mL時(shí)Caspase-3酶活性最低，300 ind/500 mL時(shí)最高達(dá)33.85 nmol/mg/h，在密度大于150 ind/500 mL時(shí)酶活性提高迅速?？傮w上看隨著密度的升高蚤狀溞Caspase-3的酶活性也隨之顯著升高(P<0.05)。與caspase-3 mRNA在不同密度下的表達(dá)趨勢(shì)一致。

圖7 蚤狀溞Caspase-3的酶活性在不同密度下的變化Figure 7 Changes of enzyme activity of Caspase-3 in D.pulex at different densities

2.3.3 蚤狀溞Caspase-3酶活性在不同食物條件下的變化

從圖8中可以看出，在本實(shí)驗(yàn)中“Banta糞土培養(yǎng)液”組Caspase-3酶活性低于小球藻組，但無(wú)顯著差異(P>0.05),結(jié)果與caspase-3 mRNA在不同食物條件下的表達(dá)趨勢(shì)一致。

圖8 蚤狀溞Caspase-3的酶活性在不同食物條件下的變化Figure 8 Changes of enzyme activity of Caspase-3 in D.pulex with different food species

2.4 整體原位雜交檢測(cè)caspase-3基因在蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的表達(dá)

原位雜交檢測(cè)caspase-3基因，用探針對(duì)孤雌溞和兩性溞進(jìn)行整體原位雜交定位和表達(dá)分析。藍(lán)色的深淺表示反義探針在對(duì)應(yīng)部位上陽(yáng)性信號(hào)的強(qiáng)弱，正義探針對(duì)照組則沒(méi)有陽(yáng)性信號(hào)。表達(dá)定位結(jié)果顯示caspase-3基因在蚤狀溞活體細(xì)胞幾乎均有表達(dá)，但在孤雌成溞中表達(dá)量較低，在兩性溞中表達(dá)量較高。定位結(jié)果顯示除腸道和卵鞍外caspase-3 mRNA在溞體全身基本都有表達(dá)，廣泛定位在胸肢、第一觸角、第二觸角和性腺等部位(圖9)。

3 討論

3.1 溫度對(duì)蚤狀溞caspase-3 mRNA表達(dá)和酶活的影響

對(duì)于溫度對(duì)枝角類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，已經(jīng)有了很多相關(guān)的研究。其壽命因溫度升高而縮短[16]。在正常細(xì)胞中Caspase-3活性被嚴(yán)格調(diào)節(jié)，激活的Caspase-3是較少的，即使在凋亡細(xì)胞內(nèi)也只有一部分Caspase-3蛋白被切割參與凋亡過(guò)程，少量的增加即可檢測(cè)到顯著差異[17-18]。

圖9 caspase-3基因在蚤狀溞中原位雜交位點(diǎn)Figure 9 In situ hybridization site of caspase-3 in D.pulex

注：An1：第一觸角;An2：第二觸角;T：胸肢;G：性腺;I：腸。 a為空白對(duì)照;b為陰性對(duì)照，正義探針;c-d為實(shí)驗(yàn)組，反義探針(c為孤雌成溞，d為兩性雌溞)

Caspase-3在凋亡早期即可檢測(cè)到，因此半胱天冬蛋白酶-3活性作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記[19]。Caspase-3活性與年齡正相關(guān)[20-21]，隨著年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞死亡和促進(jìn)器官凋亡加劇[22]。而Caspase-3酶原的表達(dá)量水平高低對(duì)衰老進(jìn)程沒(méi)有直接影響[23]，也就是說(shuō)Caspase-3低水平活化可使患者更好地康復(fù)或存活更久，而與Caspase-3酶原則無(wú)關(guān)系[24]，所以可以認(rèn)為除了蚤狀溞在分化和蛻變時(shí)，caspase-3 mRNA的表達(dá)量增高表明衰老進(jìn)程加劇。

在15℃、20℃、25℃和30℃和室溫下培養(yǎng)的蚤狀溞中，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示caspase-3 mRNA表達(dá)量與酶活的變化趨勢(shì)相一致，即隨著溫度的上升而呈顯著的增加(P<0.05)。當(dāng)溫度低的時(shí)候，溞體的循環(huán)生理和營(yíng)養(yǎng)代謝水平較低，當(dāng)溫度高的時(shí)候則其水平相對(duì)會(huì)增加，細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、衰老以及凋亡的速率都會(huì)增快，從而縮短生殖周期以致衰老加快。但室溫處于10℃～18℃，平均溫度小于20℃時(shí)，其mRNA表達(dá)量卻比20℃培養(yǎng)下的高，這可能是當(dāng)溫度降低時(shí)蚤狀溞的生理活動(dòng)會(huì)驟然減慢，從而損傷溞體，以致于加快了細(xì)胞的凋亡，caspase-3 mRNA表達(dá)量上升。這和賈旭穎等[14]研究淡水養(yǎng)殖的南美白對(duì)蝦，得出其肝胰腺caspase-3活性在低溫突變后顯著升高的結(jié)論相同。室溫組caspase-3 mRNA表達(dá)量高于20℃組而Caspase-3酶活與20℃組無(wú)顯著差異有可能是兩組的上限溫度接近所致。

3.2 種群密度對(duì)蚤狀溞caspase-3 mRNA表達(dá)和酶活的影響

種群密度對(duì)枝角類(lèi)的生長(zhǎng)繁育有重大的影響。一般認(rèn)為，密度增高使枝角類(lèi)種群增長(zhǎng)速度變慢，冬卵發(fā)生率增大，是由于高密度造成代謝產(chǎn)物積累，餌料缺乏所致。陸開(kāi)宏[25]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)密度與隆線(xiàn)溞冬卵發(fā)生率、產(chǎn)仔率及個(gè)體增長(zhǎng)速度都有明顯相關(guān)關(guān)系。

在培養(yǎng)密度為50只/500 mL、100只/500 mL、150只/500 mL、200只/500 mL和300只/500 mL蚤狀溞中，qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示caspase-3 mRNA表達(dá)量以及酶活隨密度上升呈增加趨勢(shì)，在低培養(yǎng)密度50～100只/500 mL時(shí)的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P>0.05)，之后呈顯著上升(P<0.05)。與蚤狀溞的種群密度越高，其衰老程度越高的規(guī)律相一致[26]。結(jié)合蚤狀溞的生長(zhǎng)情況的觀察，密度為50～100 ind/500 mL的蚤狀溞在第8天的時(shí)候大多已產(chǎn)仔過(guò)，甚至有少部分溞懷卵第二胎，而高密度組的蚤狀溞大多只是剛開(kāi)始產(chǎn)第一胎，且密度越高蚤狀溞個(gè)體越小，所產(chǎn)幼溞也越少。當(dāng)密度較低的時(shí)候，蚤狀溞之間的碰撞率低，生存所需要的資源比如食物、氧氣等都有富足，所以caspase-3 mRNA的表達(dá)無(wú)顯著變化。當(dāng)密度過(guò)高時(shí)，蚤狀溞之間需要搶奪生存資源，密度越高每只蚤狀溞能分得資源越少，對(duì)溞體的損傷越大，細(xì)胞凋亡水平升高，caspase-3 mRNA表達(dá)水平也會(huì)隨之升高，部分轉(zhuǎn)入兩性生殖，出現(xiàn)卵鞍。

3.3 食物種類(lèi)對(duì)蚤狀溞caspase-3 mRNA表達(dá)和酶活的影響

食物種類(lèi)也是影響蚤狀溞生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一。在之前的研究中，以小球藻為食的蚤狀溞生長(zhǎng)繁育狀況優(yōu)于以Banta糞土培養(yǎng)液培養(yǎng)的溞[27]。但在本實(shí)驗(yàn)中卻出現(xiàn)了相反的情況，在qPCR的檢驗(yàn)中Banta組caspase-3 mRNA的表達(dá)量小于小球藻組溞，意味著小球藻組的溞的衰老情況略高于Banta組溞。酶活測(cè)定結(jié)果也與此相同。雖然兩者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但在平時(shí)的觀察中，小球藻組的蚤狀溞生長(zhǎng)狀況是劣于Banta培養(yǎng)液組的，具體表現(xiàn)為溞體較小，懷卵量較少。究其原因，有可能是小球藻組中小球藻的生長(zhǎng)狀況過(guò)于旺盛，以至于蚤狀溞對(duì)小球藻的消耗量小于小球藻本身的生長(zhǎng)速度，導(dǎo)致水體的含氧量、光線(xiàn)等有較大的變化，惡化了蚤狀溞的生存環(huán)境，也有可能是平時(shí)馴化和保種的時(shí)候都用的是Banta培養(yǎng)液，可能使蚤狀溞更加適應(yīng)Banta培養(yǎng)液。因條件有限，關(guān)于這些推測(cè)還有待于以后的研究。

3.4 caspase-3基因在蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的定位表達(dá)

雖然目前研究caspase-3基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制已有不少報(bào)道，但關(guān)于caspase-3基因的定位研究的報(bào)道仍然較少[28]。本研究用DIG標(biāo)記的RNA探針檢測(cè)caspase-3 mRNA在蚤狀溞不同生殖狀態(tài)下的定位表達(dá)。整體原位雜交結(jié)果顯示，caspase-3基因的定位表達(dá)廣泛，在蚤狀溞活體細(xì)胞幾乎都有表達(dá)，在胸肢、第一觸角、第二觸角上和性腺等部位均有表達(dá)，符合Caspase-3在細(xì)胞中合成為無(wú)活性的酶原，普遍分布在細(xì)胞質(zhì)中[29]。caspase-3基因在兩性溞中表達(dá)量較高，孤雌成溞中表達(dá)量較低。在張萌萌[30]蚤狀溞的研究中，caspase-3 mRNA表達(dá)量隨年齡(1、10、15、20和25 d)增長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)(P<0.05)，酶活力測(cè)定也顯示Caspase-3活性隨年齡增長(zhǎng)而顯著增長(zhǎng)(P<0.05)，意味著隨溞年齡的增長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡加劇。即表明除了各種環(huán)境因子刺激外，衰老也是一種凋亡的啟動(dòng)因素。雖然環(huán)境因子與蚤狀溞的生殖模式轉(zhuǎn)換有密切關(guān)系，但在不同的培養(yǎng)環(huán)境中，隨著溞齡的增長(zhǎng)，也會(huì)產(chǎn)生兩性溞和卵鞍，即在培養(yǎng)環(huán)境條件好的情況下隨著溞年齡的增長(zhǎng)，衰老進(jìn)程的發(fā)展，最后從量變發(fā)生了質(zhì)變，進(jìn)入兩性生殖模式。因此我們推測(cè)枝角類(lèi)進(jìn)行有性生殖主要是由內(nèi)部因素決定，環(huán)境變化僅在一定程度上起誘導(dǎo)作用。

caspase-3基因?yàn)榄h(huán)境敏感型基因，caspase-3基因的表達(dá)與環(huán)境有關(guān)，蚤狀溞的衰老和caspase-3 mRNA的表達(dá)及Caspase-3的酶活有關(guān)，而壽命和兩性溞的產(chǎn)生相關(guān)，但環(huán)境因子如何影響caspase-3基因的表達(dá)進(jìn)而通過(guò)衰老相關(guān)基因調(diào)控枝角類(lèi)生殖轉(zhuǎn)換還需今后進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

通過(guò)Real-Time PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，caspase-3 mRNA與Caspase-3酶活性增長(zhǎng)規(guī)律相一致。蚤狀溞caspase-3 mRNA 的表達(dá)量和酶活整體隨著溫度和種群密度的增長(zhǎng)而增加。以Banta培養(yǎng)液培養(yǎng)的蚤狀溞caspase-3 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異。原位雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，caspase-3基因在蚤狀溞活體細(xì)胞幾乎都有表達(dá)，且在不同生長(zhǎng)環(huán)境條件下均有表達(dá)，在兩性溞中表達(dá)量較高，孤雌成溞中表達(dá)量較低。caspase-3 mRNA的表達(dá)廣泛分布在溞的胸肢、第一觸角、第二觸角和生殖腺等部位上。研究認(rèn)為高溫度和高種群密度能夠提高蚤狀溞caspase-3 mRNA 的表達(dá)量并產(chǎn)生卵鞍。蚤狀溞的衰老和caspase-3的表達(dá)有關(guān)，caspase-3的表達(dá)與環(huán)境因子有關(guān)，但環(huán)境因子如何影響caspase-3的表達(dá)需今后進(jìn)一步的研究。該研究可為今后探索衰老相關(guān)基因調(diào)控蚤狀溞生殖轉(zhuǎn)換的分子機(jī)制提供一些理論依據(jù)和參考。