劉琳，彭小彧，張曉梅，王麗萍，張樹成，王寧，呂芳

(1.揚州大學臨床醫(yī)學院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學中心，揚州 225001；2.大連醫(yī)科大學婦產(chǎn)科，大連 116044；3.揚州大學臨床醫(yī)學院/江蘇省蘇北人民醫(yī)院生物樣本庫，揚州 225001；4.國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所，北京 100081)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是以無排卵性不孕、激素水平紊亂為特征的內(nèi)分泌疾病，影響世界約8%～10%育齡期婦女，其具體發(fā)病機制目前尚未明確。外泌體是由多種細胞分泌的小細胞囊泡，可釋放有活性的蛋白、mRNA和miRNA等。有研究推測外泌體在多囊卵巢綜合征患者體內(nèi)充當類似“電話線”的角色，將信號通過血液循環(huán)傳遞至多個器官從而參與發(fā)病。本文檢索Pubmed、Springer-Link、Elsevier Science等數(shù)據(jù)庫的相關(guān)文獻做簡要綜述。

一、外泌體的基本概念

1.外泌體的生物學特性：“外泌體”最初是指各種培養(yǎng)細胞中攜帶5’-核苷酸酶活性細胞釋放的囊泡，目前主要指由多種細胞分泌的納米級微囊泡[1]。研究表明，幾乎體內(nèi)的任何細胞均可分泌產(chǎn)生外泌體，其廣泛存在于血液、乳液、胎盤、羊水中，還可從腹腔積液、卵泡液中分離得出[2]。外泌體直徑約30～100 nm[2]，因此它既可以通過質(zhì)膜受體直接激活靶細胞，也可以作為載體轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、細胞器甚至病毒進入靶細胞內(nèi)，作為信號因子改變靶細胞生物活性及功能[3]。外泌體的成分有主要組織相容性復合物(MHC，如MHCⅠ類、MHCⅡ類分子)、整合素、熱休克蛋白及生物酶類等。不同細胞來源的外泌體所含RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)均有所差異，功能也不盡相同[4]。外泌體參與細胞間信號轉(zhuǎn)導的生物學過程、參與細胞增殖和代謝的過程；外泌體攜帶的核酸可促進腫瘤細胞的迅速增殖和腫瘤部位血管生成等[5]。外泌體詳細信息可登陸外泌體數(shù)據(jù)庫(http：//www.exocarta.org/)查詢。截止2019年3月20日，該數(shù)據(jù)庫共收錄蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)41 860條，mRNA數(shù)據(jù)4 946條，miRNA數(shù)據(jù)2 838條和脂質(zhì)數(shù)據(jù)1 116條。

2.外泌體的形成與釋放：外泌體的生成有多種機制，其中較為普遍是細胞膜向內(nèi)凹陷，形成含有多種膜表面蛋白、外源性的抗原及脂類的早期內(nèi)涵體；隨后內(nèi)涵體在細胞內(nèi)再次內(nèi)陷，包裹胞質(zhì)內(nèi)的蛋白、核酸等形成多囊泡小體；最后多囊泡小體與細胞膜融合，將其中的小囊泡釋放到細胞外，形成外泌體[6]。

3.外泌體與靶細胞間的相互作用機制：目前，外泌體與靶細胞間相互作用最有可能的三種機制分別為：外泌體直接與靶細胞結(jié)合；外泌體被靶細胞完全內(nèi)吞；外泌體通過其表面的特性蛋白分子與靶細胞結(jié)合。

二、外泌體與PCOS

PCOS臨床診斷雖有鹿特丹標準，但地域和種族不同、患者的臨床表現(xiàn)具有高度異質(zhì)性為PCOS診斷和檢測帶來困難，早發(fā)現(xiàn)早診斷對于合并不孕癥的PCOS患者具有十分積極意義。研究表明，卵泡發(fā)育異常與PCOS患者的發(fā)病密切相關(guān)。正常卵巢內(nèi)會呈現(xiàn)多個不同發(fā)育階段卵泡并存現(xiàn)象，而卵泡發(fā)育過程中，卵泡液是卵母細胞生存的直接內(nèi)環(huán)境，卵泡液的含量及成分(如生長因子、激素水平等)在不同的階段代謝物質(zhì)不同，其變化直接影響卵泡的發(fā)育及成熟[7]。

Huang等[8]通過微陣列基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)PCOS與非POCS患者卵丘細胞中l(wèi)ncRNA的表達明顯不同。外泌體內(nèi)的mRNA可穩(wěn)定的表達于唾液、血液和卵泡液中，不易受內(nèi)環(huán)境影響而變化，便于檢測。同時在外泌體中檢測到miRNA、lncRNA等的存在[9-10]。2012年da Silveira等[11]首次發(fā)現(xiàn)馬卵泡液來源的外泌體內(nèi)含有miRNA及蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細胞可吸收從卵泡液中提取的外泌體。該研究同時證實miR-181A、miR-375等隨母馬的年齡增長而出現(xiàn)表達下降，證明外泌體攜帶的miRNA與年齡相關(guān)。隨后在牛卵泡液外泌體中提取大量的miRNA發(fā)現(xiàn)，生長期卵泡液外泌體中miR-654-5p和miR-640呈高表達，而成熟卵泡液外泌體中miR-373呈高表達，表明卵泡液中提取的外泌體有助于卵泡的生長發(fā)育[12-13]。檢測卵泡液或血液中提取外泌體內(nèi)特定的RNA表達以協(xié)助PCOS患者的早期診斷，具有十分重要的意義。

近期在卵泡液中檢測并確定了120個miRNAs及靶基因[14]，有11種miRNAs高表達同時參與生殖途徑的內(nèi)分泌和代謝過程。其中miR-132和miR-320顯著降低，其靶基因分別為HMGA2和PAB5B，是兩個與PCOS的發(fā)病相關(guān)的關(guān)鍵基因。而Naji 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者卵泡液來源的miRNA在女性生殖系統(tǒng)和卵泡形成的正常功能中起著至關(guān)重要的作用，并證實在顆粒細胞(GLCs)、濾泡液(FF)和PCOS患者血清中的miR-182、miR-145表達下降，推測miRNA參與PCOS發(fā)病進程。Daskalopoulos等[16]研究發(fā)現(xiàn)，脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)可增加患PCOS和心血管疾病的風險。隨著危險因素的增加，PCOS患者體內(nèi)的外泌體在體內(nèi)的循環(huán)水平增加[17-18]。上述研究沒有很好的同質(zhì)性，但可推測外泌體內(nèi)含有的特定表型RNA在PCOS的發(fā)病中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用于臨床檢測前需大量實驗驗證和補充。

三、外泌體分離和檢測方法

1.超速離心法：為目前常用的外泌體純化手段。首先將卵泡液在4 ℃下300×g離心10 min，2 000×g離心20 min，棄沉淀后經(jīng)10 000×g離心30 min，再次棄沉淀，最后經(jīng)過100 000×g離心后棄上清液，所得沉淀即為外泌體。此方法優(yōu)點是提取量多，缺點為提取純度不足，回收率不穩(wěn)定，重復離心可能會損傷囊泡，在電鏡下外泌體會聚集成塊。

2.過濾離心法：過濾離心法是利用生物膜的孔徑分離原理對樣品進行離心獲得外泌體，即利用超濾膜大分子物質(zhì)留下而小分子物質(zhì)可通過超濾膜濾出。該方法優(yōu)點是省時高效，且不易損傷外泌體；缺點是獲得的純度相對不足，且易殘留粘附在超濾膜上，降低濾膜壽命。此方法外泌體的產(chǎn)量較少，不足以支持需要大量外泌體的試驗的開展。

3.免疫磁珠法：在離心法的基礎(chǔ)上，將待測樣本與抗體包被的免疫磁珠混勻，室溫孵育后將待分離樣本緩緩加入到分離柱中，然后將分離柱移出磁性分離器，并用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗。該方法操作簡單且分離純度較高，能夠保證外泌體形態(tài)的完整，但非中性pH值會影響外泌體的生物活性，不適用于大體積樣本的分離，因此不利于后續(xù)功能實驗的進行及此方法的推廣。

4.ExoQuick Precipitation法：采用ExoQuick試劑盒，將卵泡液以3 000×g離心15 min取上清液，加入沉淀劑(減少囊泡的水化改變?nèi)芙舛?再次離心棄上清，獲得完整的外泌體并且能有效去除提取樣品中的雜蛋白。該方法主要依賴于聚合物共沉淀以獲取更豐富的外泌體。但其生物活性易受試劑濃度及pH的影響，且試劑盒價格昂貴，不適于大規(guī)模外泌體的提取。

5．螺旋超濾法：螺旋超濾法是利用螺旋超濾儀進行外泌體提取。首先將收集的卵泡上清液分別置于2個15 ml離心管中，依次經(jīng)過300×g和2 000×g4℃離心取得上清液，過濾后經(jīng)螺旋超濾儀反復超濾3次，并使用 PBS反復沖洗，最后放入Eppendorf管中于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。此法可高速、快捷獲得外泌體，較為常用。

6.分子排阻色譜法：分子排阻色譜法通過凝膠過濾將囊泡與其它分子相分離，凝膠主要由球形顆粒組成，這些顆粒在特定部位分布有氣孔[19]。當樣品進入凝膠時，小分子可直接擴散進入氣孔，而大分子則直接被洗脫下來，因此大分子比小分子易分離，該方法是利用復雜的生物學特性實現(xiàn)外泌體的分離，是近期才應(yīng)用于分離囊泡的方法。在實際操作過程中，還應(yīng)將設(shè)備類型、孔徑大小及流速等因素考慮在內(nèi)，以獲得純度較高而功能良好的外泌體。

7.外泌體定量檢測方法：采集外泌體首先通過離心、免疫磁珠等方法進行分離和富集，但因純度不足、缺乏公認的分離方法極大地限制了對外泌體的定量研究，本文收集多種外泌體提取方法進行綜合分析。納米粒子追蹤分析(Nanopa rticle tracking analysis，NTA)是一種利用外泌體物理性質(zhì)來進行定量分析的方法，利用光散射來檢測納米顆粒的分布及濃度的分布，可同時對不同大小及分布的樣本進行分析[20]，盡可能減少在處理樣本中的污染。電化學傳感器是一種利用外泌體的電化學性質(zhì)對外泌體進行定量分析的方法，此方法具有特性佳、靈敏度高、容易獲取的優(yōu)勢。表面等離子體共振(SPR)技術(shù)，可以對無標記的外泌體進行實時定量檢測，靈敏度高還可省去熒光標記的步驟，方便快捷。

四、治療及展望

外泌體在許多生物合成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，其攜帶的RNA和蛋白質(zhì)含量可反映其起源細胞水平。因此，外泌體的量化研究在未來的研究中顯得至關(guān)重要[5，21]，特別是對于疾病的早期診斷和早期治療。PCOS患者體內(nèi)特殊的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)狀態(tài)常與自然流產(chǎn)、妊娠期糖尿病和妊娠期高血壓等疾病的發(fā)病密切相關(guān)[22-23]。由于PCOS有很大的異質(zhì)性，因此治療方案通常給予個體化指導、運動指導及促排卵藥物，但妊娠結(jié)果往往不盡如人意。外泌體作為一種多效的生物活性載體，參與細胞信號轉(zhuǎn)導、廢物的管理，由于其性質(zhì)較為穩(wěn)定，相對于一般生物標記物，可提供大量特異性和敏感性指標[24]。因此對PCOS患者實時監(jiān)控外泌體的水平，對于診斷和治療有十分重要的意義。若外泌體作為診斷生物標記物，可很大程度上提高PCOS診斷的準確性。

經(jīng)過大量研究證實，外泌體現(xiàn)已成功作為乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥的循環(huán)生物標記物和轉(zhuǎn)移前攜帶腫瘤相關(guān)分子[25-26]。同時也作為一些疾病的潛在標記物，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變、阿爾茲海默病等[27-28]，目前也嘗試將外泌體轉(zhuǎn)為有前途的治療疾病的疫苗[29]。進一步研究外泌體，尤其是外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)、miRNA、lncRNA及circRNA在生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病中的作用機制，將為外泌體作為疾病診斷、治療和預后的下一代生物標志物奠定基礎(chǔ)。