馬欣娟 孫玉梅 謝詩怡

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034)

冰酒也稱冰葡萄酒，是一種利用自然冰凍的葡萄釀造的甜葡萄酒[1]。各國的冰酒標(biāo)準(zhǔn)有所不同，加拿大酒商聯(lián)盟(Vintners Quality Alliance，VQA)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，必須使用在-8 ℃以下掛在葡萄枝上經(jīng)過自然冰凍的葡萄，壓榨出的冰葡萄汁的糖度應(yīng)在320 g/L[1]以上，且酒中殘?zhí)遣坏陀?25 g/L，酒精度為7.0%～14.9%，總酸不低于6.5 g/L[2]，這樣的葡萄酒才能稱為冰酒。

冰酒生產(chǎn)工藝使冰酒發(fā)酵處于高糖和低溫狀態(tài)，酵母在高糖低溫條件下生長和代謝困難，使冰酒發(fā)酵可能面臨更多遲緩或停滯的問題。引起發(fā)酵遲緩和停滯的原因主要是冰葡萄汁成分和發(fā)酵工藝。初糖濃度過高、氮缺乏、發(fā)酵溫度過高或過低、SO2過量添加、溶氧量不足及其他因素(陽離子缺乏、乙醇毒性、有機(jī)酸和脂肪酸毒性、農(nóng)藥和殺蟲劑殘留、微生物競爭和不良的釀酒環(huán)境)共同作用，使冰酒需發(fā)酵數(shù)月才能完成[3]。

而發(fā)酵遲緩涉及延遲啟酵和降低發(fā)酵速度，會影響冰酒品質(zhì)；發(fā)酵停滯則是在達(dá)到所需酒精度前酵母停止酒精發(fā)酵，從而導(dǎo)致發(fā)酵不完全，降低冰酒品質(zhì)[4]。為了保證冰酒的正常發(fā)酵和品質(zhì)，研究和了解冰酒發(fā)酵遲滯的原因至關(guān)重要。

1 導(dǎo)致冰酒發(fā)酵遲滯的因素

1.1 冰葡萄汁成分

1.1.1 還原糖 還原糖作為冰酒發(fā)酵的能源和碳源，其含量對冰酒發(fā)酵進(jìn)程有很大影響。通常每生成體積分?jǐn)?shù)1%的酒精需要消耗17～18 g/L糖，葡萄汁中初糖濃度高于180 g/L時，才能獲得酒精度為10%的葡萄酒[5]58-60。原料初糖濃度的增加會明顯延長發(fā)酵周期[3]，由于發(fā)酵冰酒所用的葡萄是經(jīng)過冰凍濃縮的，因此其中的還原糖濃度通常>360 g/L。當(dāng)初糖濃度>400 g/L時，會提高發(fā)酵環(huán)境的滲透壓，導(dǎo)致部分酵母菌失水萎縮，影響酵母菌的生長和代謝，造成發(fā)酵遲滯；當(dāng)初糖濃度>520 g/L時，過高的滲透壓會使大部分酵母細(xì)胞失水死亡，導(dǎo)致冰酒發(fā)酵遲滯[6-7]。在冰酒發(fā)酵過程中，糖分子移動到酵母細(xì)胞中需要首先結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白[8]。轉(zhuǎn)運蛋白(高親和力轉(zhuǎn)運蛋白)是具有多個底物識別或結(jié)合位點的開放結(jié)構(gòu)，在初糖濃度低時這些轉(zhuǎn)運蛋白能夠從多個位置識別和結(jié)合糖；在初糖濃度高的情況下，當(dāng)多個糖分子試圖同時結(jié)合具有多個底物識別位點的轉(zhuǎn)運蛋白時，就會堵塞轉(zhuǎn)運蛋白，因此糖分子無法轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，糖的總攝取速率降低，從而導(dǎo)致發(fā)酵遲滯[8]。

與葡萄糖相比，高濃度的果糖對酵母的生長具有抑制作用，且果糖的利用率相對較低，原因可能與己糖激酶Ι活性水平的缺乏有關(guān)[9]。已有研究[10]表明，添加果糖使葡萄糖果糖比(Glucose to Fructose Ratio，GFR)增大會抑制正在進(jìn)行的發(fā)酵，而添加葡萄糖使GFR>1可以促進(jìn)正在進(jìn)行的發(fā)酵。

因此，對糖濃度過大的濃縮葡萄汁，需要先稀釋葡萄汁再進(jìn)行冰酒發(fā)酵，避免發(fā)酵遲滯。

1.1.2 可同化氮 冰葡萄汁中有有機(jī)氮和無機(jī)氮兩類氮源，其中能被酵母利用的氮源統(tǒng)稱為酵母可同化氮(Yeast Assimilable Nitrogen，YAN)[11]。冰葡萄汁的可同化氮含量過低時，酵母菌無法正常繁殖代謝，易造成發(fā)酵遲滯；氮含量過高時，會使發(fā)酵液中有害微生物繁殖，影響發(fā)酵進(jìn)程并生成對冰酒產(chǎn)生不利影響的代謝產(chǎn)物，影響冰酒品質(zhì)。通常認(rèn)為，酵母發(fā)酵達(dá)到酒精度7%至少需要150 mg/L·YAN，適宜發(fā)酵的可同化氮含量為200～500 mg/L·YAN，超過500 mg/L·YAN則被視為過量[12]。

由于冰酒葡萄汁中糖濃度過高，YAN往往無法滿足酵母菌正常發(fā)酵，會使發(fā)酵停滯。初糖濃度為320～370 g/L 的長相思和賽美容冰葡萄汁，在可同化氮含量為50～300 mg/L發(fā)酵時，商業(yè)釀酒酵母ST的最大菌濃與可同化氮含量呈正比，且發(fā)酵時間隨可同化氮含量提高而大幅縮短[13]。原料葡萄汁的可同化氮含量與葡萄品種也有關(guān)，釀造冰酒的葡萄品種主要有雷司令、威代爾、霞多麗、貴人香、米勒、瓊瑤漿、白品諾、灰品諾、美樂、長相思等[14]，其中，霞多麗進(jìn)行冰酒發(fā)酵遲滯的原因與糖濃度無關(guān)，而是其可同化氮含量較低(140 mg/L)所致[15]。

糖轉(zhuǎn)運蛋白在細(xì)胞穩(wěn)定期保持高效轉(zhuǎn)運[16]，必須提供可同化氮以持續(xù)再合成糖轉(zhuǎn)運蛋白。由于高濃度乙醇會抑制氨基酸和其他氮的運輸，所以在發(fā)酵前期必須提供氮源并貯藏在液泡中以備后續(xù)使用。不同菌株在發(fā)酵穩(wěn)定期的氮需求差異顯著，其差異遠(yuǎn)大于生長的氮需求差異。在釀酒條件下葡萄汁中的高濃度銨可能會抑制葡萄酒菌株對氮的高效利用和生物量的生成[17]。在發(fā)酵穩(wěn)定期添加特定氨基酸可以延長最大發(fā)酵活性周期，而銨無此作用，添加氨基酸(尤其是甘氨酸)可以增強(qiáng)糖轉(zhuǎn)運蛋白等被降解蛋白的快速合成能力[18]?？梢?，適宜的氮營養(yǎng)對完成釀酒條件下的發(fā)酵非常重要，必須保持含氮化合物對最佳利用和生長的平衡。

基于上述分析，為避免冰酒發(fā)酵遲緩，必須保證葡萄汁在發(fā)酵前期含氮充足，在發(fā)酵過程中添加甘氨酸等氨基酸并控制銨含量不能過高。

1.1.3 其他成分 葡萄種植過程中，葡萄藤可以通過其根系或通過與含有金屬離子(銅、鐵)的殺真菌劑直接接觸來吸收少量重金屬并傳遞到葡萄中，會抑制酵母細(xì)胞生長，進(jìn)而影響冰酒發(fā)酵[19]。

海藻糖可以保護(hù)酵母細(xì)胞免受滲透壓脅迫和乙醇毒性，提高酵母細(xì)胞活力[20]。葡萄汁中海藻糖含量豐富[21]。因此，防止冰葡萄汁中海藻糖流失可以提高細(xì)胞活力和發(fā)酵速率。

1.2 發(fā)酵工藝

1.2.1 溫度 冰酒發(fā)酵過程的溫度控制與冰酒的品質(zhì)有著極其密切的關(guān)系。不同酵母菌株所需的發(fā)酵溫度不同。采用商業(yè)酵母菌株K1-V1116對威代爾冰葡萄汁發(fā)酵時，在溫度低于5 ℃時會抑制酵母菌活性，造成發(fā)酵遲緩，而溫度高于10 ℃時，乙醇的生成量隨溫度升高明顯增加[3]。釀酒酵母Y-1# 在10～20 ℃發(fā)酵威代爾冰葡萄汁時，隨發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵周期明顯縮短，乙醇、乙酸和耗糖量均增加[22]。葡萄酒酵母CICC 31604在20，25，30 ℃發(fā)酵北冰紅冰葡萄汁，發(fā)現(xiàn)20 ℃和30 ℃均會抑制酵母生長，使發(fā)酵遲緩、耗糖和乙醇產(chǎn)量較低，冰酒感官評定較差[23]。

在冰酒發(fā)酵過程中，較低溫度會降低細(xì)胞膜的流動性并限制轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象變化，而高溫會增加細(xì)胞膜的流動性并在構(gòu)象變化過程中導(dǎo)致轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)的過度解離，進(jìn)而影響發(fā)酵速率[8]。發(fā)酵罐中葡萄汁的溫度可能不均勻，靠近罐壁的溫度較低，而靠近罐中心的溫度較高。應(yīng)避免發(fā)酵溫度高于30 ℃，以防由于菌株的發(fā)酵速率和系統(tǒng)的傳熱能力使發(fā)酵溫度快速升高到抑制發(fā)酵的程度，引起發(fā)酵停滯[8]。在發(fā)酵后期溫度會下降，過度冷卻也會導(dǎo)致發(fā)酵停滯，應(yīng)避免在劇烈發(fā)酵結(jié)束后罐體持續(xù)冷卻而發(fā)生的劇烈降溫(使溫度波動不宜超過5 ℃)。不同酵母菌株的發(fā)酵溫度應(yīng)保持在22～25 ℃。

1.2.2 酵母菌種及其使用方法 冰酒的自然發(fā)酵周期較長，為保證發(fā)酵的順利進(jìn)行和冰酒品質(zhì)的穩(wěn)定，工業(yè)生產(chǎn)中通常采取接種商業(yè)酵母的方法發(fā)酵冰酒。Daniel等[24]采用7種商業(yè)酵母進(jìn)行冰酒發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)不同酵母菌種發(fā)酵速率不同，快者17 d而慢者長達(dá)數(shù)月才能完成發(fā)酵。Bely等[25]分別使用非釀酒酵母Torulspora.delbrueckii(27828和31703)和釀酒酵母ST發(fā)酵初糖濃度為360 g/L的葡萄漿，發(fā)現(xiàn)T.delbrueckii菌株的發(fā)酵周期較長(20 d和26 d)，且具有較低的乙醇和乙酸產(chǎn)量，而釀酒酵母ST僅11 d就完成發(fā)酵。

現(xiàn)代葡萄酒生產(chǎn)通常采用活性干酵母，活性干酵母在使用前需適當(dāng)?shù)膹?fù)水馴化以提高酵母活力，進(jìn)而縮短發(fā)酵周期。復(fù)水溫度直接影響了酵母的活力，40 ℃復(fù)水，酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖會提高酵母細(xì)胞活力。但無論酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖水平如何，低于40 ℃復(fù)水會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物進(jìn)入復(fù)水介質(zhì)，使酵母細(xì)胞死亡率升高，造成發(fā)酵遲滯。60 ℃復(fù)水，會造成細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層從干凝膠到液晶相的相變，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物損失，細(xì)胞活力降低[26-27]。對商業(yè)酵母菌株K1-V1116直接接種和逐步復(fù)水馴化后接種，發(fā)酵結(jié)果表明直接接種的酵母生長較慢、耗糖和乙醇產(chǎn)量較少，發(fā)酵遲緩；復(fù)水馴化后接種的酵母生長較快、耗糖和乙醇產(chǎn)量較多，發(fā)酵進(jìn)程加快[3]。

酵母菌種的接種量也與發(fā)酵遲滯有關(guān)。采用釀酒酵母 Y-1#、Y-2# 和 Y-3# 發(fā)酵初糖350 g/L的威代爾冰葡萄汁，接種量為0.3 g/L的發(fā)酵周期較長，而接種量為0.5 g/L的發(fā)酵周期較短[22]。

冰酒發(fā)酵的糖度較高且溫度較低，需要選擇耐高糖、耐低溫、生長繁殖速度快、啟酵早、揮發(fā)酸和有機(jī)酸生成量低的酵母以提高細(xì)胞活力，減少葡萄酒中有害代謝產(chǎn)物的積累，縮短發(fā)酵周期[28]405-408[29-31]。除選取適合冰酒發(fā)酵的酵母外，發(fā)酵前通常要對酵母菌進(jìn)行梯度馴化或復(fù)水，且酵母的復(fù)水溫度保持在40 ℃為宜。當(dāng)糖度高于 5 °Brix時，應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)接種量0.25 g/L提高至0.35 g/L以上，以達(dá)到快速啟酵的目的并保證發(fā)酵完全[6]。

1.2.3 二氧化硫添加量 冰酒發(fā)酵過程中添加SO2可以起到抗氧化、降酸、護(hù)色、澄清和抑制微生物生長等重要作用，影響葡萄酒的感官品質(zhì)[32]。SO2在葡萄酒釀造過程中最大使用量為250 mg/L，適量SO2可以與乙醛及其他相似物結(jié)合，降低酒中乙醛含量及過氧化味，產(chǎn)生令人愉悅的香氣，從而改善冰酒風(fēng)味[33]。過量使用SO2會產(chǎn)生刺激性的H2S氣體，抑制酵母的生長繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵遲滯，還會影響人體健康[5]131-137。SO2可以抑制蘋果酸—乳酸發(fā)酵，從而降低冰酒發(fā)酵時揮發(fā)酸的生成量，當(dāng)冰葡萄汁的初始糖度為350～400 g/L時，隨SO2添加量(30～150 mg/L)升高，發(fā)酵周期明顯延長[34]。當(dāng)發(fā)酵到冰酒所需酒精度時，可以通過添加150～200 mg/L的SO2終止發(fā)酵。

1.2.4 溶氧量 酵母菌生長繁殖需要氧氣。發(fā)酵液初始溶氧量影響酵母菌的繁殖，從而影響發(fā)酵周期。在冰酒發(fā)酵的高糖低溫環(huán)境中，可以通過攪拌提高溶解氧量至7～8 mg/L，有助于酵母菌快速的生長繁殖[28]362-365[35]。酵母厭氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇，發(fā)酵液中溶氧量過高會使酵母菌不停繁殖，而延遲啟動酒精發(fā)酵，推遲發(fā)酵進(jìn)程；此外，溶氧過量還會影響冰酒質(zhì)量，特別是對風(fēng)味物質(zhì)(如花香和果香)造成不可逆的損失[14]。Fornairon等[36]研究表明，溶氧量過少時，霞多麗葡萄汁的發(fā)酵遲緩。

2 發(fā)酵遲滯引起的冰酒成分變化

2.1 甘油

甘油具有甜味和黏性，高于5.2 g/L時可以產(chǎn)生甘甜感，還可以中和葡萄酒中的辣感和苦味，影響酒體厚度，從而改善冰酒感官質(zhì)量。因其無揮發(fā)性、無氣味，所以不會對葡萄酒的香氣造成影響。冰酒發(fā)酵的高滲透壓會刺激酵母產(chǎn)生較多甘油來保護(hù)自身。酵母甘油代謝主要由甘油三磷酸脫氫酶催化，高滲透壓會正向調(diào)節(jié)編碼甘油三磷酸脫氫酶的基因ALD3的表達(dá)，致使甘油生成量增加[6]。當(dāng)初始糖含量由230 g/L增加到450 g/L時，甘油由8.1 g/L增加到11 g/L，發(fā)酵周期由7 d延長到50 d，說明初始糖度越高，發(fā)酵周期越長，生成的甘油越多[22]。

2.2 乙醇

乙醇產(chǎn)量是判斷冰酒發(fā)酵程度的重要指標(biāo)。發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量隨初始糖含量和酵母接種量的增加而增加。當(dāng)初始糖含量由230 g/L增加到450 g/L時，發(fā)酵周期由7 d 延長到50 d，乙醇量由13.9%降到9.0%[22]。用初始糖含量為400～460 g/L的葡萄汁釀造冰酒，發(fā)現(xiàn)乙醇從11.9%降低到6.3%[37]?？梢?，較高的初糖含量會引起發(fā)酵遲緩，影響酵母的糖代謝能力，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量不足，影響冰酒品質(zhì)。采用直接和逐步馴化的商業(yè)酵母菌株K1-V1116接種發(fā)酵，接種量為0.2 g/L和0.5 g/L，在達(dá)到所需乙醇水平(11%)之前，低接種量的發(fā)酵停滯，乙醇產(chǎn)量較低(7.8%和8.1%)，而高接種量的發(fā)酵正常，且乙醇產(chǎn)量較高(10.5%和12.0%)[6]。研究[24]發(fā)現(xiàn)非釀酒酵母T.delbrueckii的發(fā)酵周期較長，且僅產(chǎn)生7.4%乙醇，而釀酒酵母ST的乙醇產(chǎn)量達(dá)15.1%。

可見，較高的初糖含量、較低的酵母接種量和非釀酒酵母菌種會引起發(fā)酵遲緩，影響酵母的糖代謝能力，導(dǎo)致乙醇產(chǎn)量不足，影響冰酒品質(zhì)。

2.3 乙酸

酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物以乙酸為主，乙酸含量過高會嚴(yán)重危害葡萄酒質(zhì)量，故其含量通常較低(0.25～0.50 g/L)。初糖濃度較高的葡萄漿發(fā)酵生成的乙酸含量較高，超過EEC(歐洲經(jīng)濟(jì)共同體)法定的1.5 g/L[13]。冰酒發(fā)酵產(chǎn)乙酸的量受溫度、菌種、接種量、可同化氮含量和初糖濃度影響。

將貴腐葡萄的初糖濃度從189 g/L增加到391 g/L，會使其所釀葡萄酒的乙酸濃度從0.56 g/L升高到1.46 g/L?？梢?，葡萄漿的高糖濃度會抑制酵母生長，生成大量乙酸[13]。

在低氮情況下，補(bǔ)加銨鹽能顯著降低乙酸生成；初始氮高于200 mg/L會增加乙酸的生成，建議葡萄漿的適宜氮濃度是190 mg/L。在接種前補(bǔ)加氮會使乙酸生成量降低18%～27%，在耗糖低于50 g/L時補(bǔ)加氮會使乙酸終濃度增加，超過發(fā)酵控制的水平[38]。

在酵母生長平衡期補(bǔ)加氮會激活己糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，提高發(fā)酵速率和乙酸生成速率，此過程沒有因生成生物量而獲得多余的NADH補(bǔ)償[39]；補(bǔ)加氮量超過190 mg/L也有相似的機(jī)制，氮過量增加了發(fā)酵速率，卻沒有相同程度地促進(jìn)生物量生成，而是直接增加了乙酸生成量[40]。

2.4 高級醇和酯類

高級醇是冰酒的主要呈味物質(zhì)，主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇等。適量的高級醇可以賦予葡萄酒特殊的風(fēng)味和香氣[12]，過多的高級醇則會給葡萄酒帶來異味，并易使人頭疼和醉酒。Chizuru等[41]發(fā)現(xiàn)用釀酒酵母Kyokaino.701發(fā)酵明顯遲緩，且異戊醇含量明顯升高，影響了冰酒的香氣。用初糖含量為24.5 °Brix和46 °Brix的葡萄汁發(fā)酵，生成的異丁醇、苯甲醇、2-苯乙醇、2-己烯醛和5-甲基糠醛隨初糖含量升高而明顯升高[42]。可見，葡萄汁初糖含量與高級醇的生成量密切相關(guān)。隨著葡萄汁初糖含量增加，葡萄酒中的γ-己內(nèi)酯和γ-丁內(nèi)酯量以及大部分酯類和酚酸類香味物質(zhì)含量增加，葡萄酒的品質(zhì)提高[43-44]。由于初始糖濃度決定發(fā)酵狀態(tài)，可以推測，發(fā)酵遲滯也將影響高級醇和各類酯類物質(zhì)的生成量，從而影響冰酒的品質(zhì)。

2.5 糖

冰酒釀造的初糖含量直接影響發(fā)酵終點冰酒的殘?zhí)橇?。酵母在不良環(huán)境條件下通常耗糖緩慢，并且在高殘?zhí)菨舛认峦l(fā)酵[8]。在高糖和低溫條件下發(fā)酵得到的冰葡萄酒中潛在殘?zhí)橇枯^高。VQA(加拿大酒商質(zhì)量聯(lián)盟)規(guī)定冰酒中殘?zhí)恰?25 g/L，酒精度為7.0%～14.9%，酸度≥6.5 g/L。中國規(guī)定冰酒殘?zhí)恰?20 g/L，酒精度7.0%～14%，酸度≥6.5 g/L，此標(biāo)準(zhǔn)保證了冰酒中糖、酒精度、酸的平衡性[45]。

3 結(jié)論和展望

迄今為止的研究表明，造成冰酒發(fā)酵遲滯的原因主要為冰葡萄汁成分和發(fā)酵工藝不當(dāng)。為保證冰酒發(fā)酵順利，避免遲滯，應(yīng)適當(dāng)控制冰葡萄汁中主要成分含量和釀造工藝。控制冰葡萄汁中初糖濃度≤40 °Brix，果糖濃度過高時可添加葡萄糖促進(jìn)發(fā)酵；保證葡萄汁足夠的含氮量，一般在200～500 mg/L，但銨含量不能過高，可以通過在發(fā)酵穩(wěn)定期添加甘氨酸促進(jìn)發(fā)酵，在耗糖高于50 g/L 時補(bǔ)加氮降低乙酸產(chǎn)量。此外，冰酒發(fā)酵需要選育耐高糖、耐低溫、生長繁殖速度快、啟酵早、乙酸生成量低的酵母；對于采用活性干酵母的冰酒發(fā)酵，接種前應(yīng)在40 ℃復(fù)水馴化活性干酵母，并適當(dāng)提高接種量。冰酒發(fā)酵的SO2添加量不宜超過250 mg/L，且應(yīng)維持7～8 mg/L 的溶氧量。發(fā)酵溫度應(yīng)保持在22～25 ℃，且避免發(fā)酵后期較大的溫度波動。

目前對于冰酒發(fā)酵遲滯的研究主要集中在原料成分、發(fā)酵工藝等原因的分析和對冰酒成分的影響，至于其他如非增殖性營養(yǎng)、植物酚類化合物和植物抗毒素對酵母生長和發(fā)酵速率的影響及其分子作用機(jī)理也值得研究。酵母基因組測序以及用于全基因組和蛋白質(zhì)組分析表達(dá)圖譜技術(shù)的出現(xiàn)，可以促進(jìn)了解冰酒發(fā)酵遲滯的酵母生物學(xué)[46]，從而為改善冰酒發(fā)酵遲滯問題提供更好的診斷工具。