李海濤，杜 瑩，宮俊峰，張國(guó)柱，郭 蕓，王慕華

（1.山西維爾生物乳制品有限公司，山西 太原 030006；2.山西藥科職業(yè)學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西省生物研究所，山西 太原 030006）

綠豆?fàn)I養(yǎng)豐富，含有蛋白質(zhì)、各種氨基酸、磷脂、多糖等成分，具有清熱解毒、增進(jìn)食欲、抗炎癥、利尿消腫、明目降壓、促進(jìn)吞噬功能的作用，對(duì)保護(hù)心腦血管、減少膽固醇、保肝也有明顯療效，是我國(guó)人民喜愛(ài)的藥食兼用食物[1]。篩選適用于綠豆乳發(fā)酵的乳酸菌，研究綠豆酸奶的發(fā)酵工藝，制備富含植物蛋白與動(dòng)物蛋白的綠豆酸奶[2-3]，有利于擴(kuò)大市場(chǎng)上酸奶的品種，同時(shí)為我國(guó)的綠豆產(chǎn)品深加工，提高綠豆的附加值提供新途徑[1]。為得到組織狀態(tài)均一的產(chǎn)品，目前關(guān)于綠豆酸奶的研制通常使用綠豆?jié){，也有個(gè)別研究使用綠豆粉。但使用這兩種方法制備的綠豆酸奶或功效、風(fēng)味不足，或組織狀態(tài)不佳，很少能真正用于生產(chǎn)。綠豆衣具有解毒、退目翳、抑制葡萄球菌的作用，綠豆仁蛋白質(zhì)含量高，富含各種營(yíng)養(yǎng)成分[4-5]。本研究以富含植物蛋白的綠豆?jié){和各種功效成分齊全的超微綠豆粉為原料制備綠豆酸奶，克服以往研究中單一使用綠豆?jié){時(shí)功效不全、風(fēng)味不足及單一使用綠豆粉組織狀態(tài)不佳的缺陷，并將植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）用于綠豆酸奶的發(fā)酵，提高綠豆酸奶的保健功效，為綠豆酸奶的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種及原料

發(fā)酵菌種：嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St），保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb），植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，Lp）：由山西維爾生物乳制品有限公司保藏。

綠豆、鮮牛乳、白砂糖：市售；康海酸奶專用穩(wěn)定劑SA2C：上?？岛Ｊ称饭I(yè)研究所。

1.1.2 化學(xué)試劑

檸檬酸二銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫80等化學(xué)試劑（均為分析純）：北京化工廠；蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，葡萄糖20 g，吐溫80 1.0 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.2～6.4，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂，121℃滅菌15 min，用于保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌的培養(yǎng)及計(jì)數(shù)。

牛奶培養(yǎng)基：牛奶脫脂后115℃滅菌15 min，冷卻后置于冰箱冷藏備用，用于菌種的活化和菌株發(fā)酵性能的研究。

1.2 儀器與設(shè)備

MJS-50磨漿機(jī)：江陰市富忠機(jī)械有限公司；JMLB-80立式膠體磨：上?？苿跈C(jī)械設(shè)備有限公司；LD-800粉碎機(jī)：常宏制藥機(jī)械設(shè)備廠；HMB-700S桌面型超微磨粉機(jī)：臺(tái)灣弘荃機(jī)械企業(yè)有限公司；SLS-60高壓均質(zhì)機(jī)：上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；WS2-84-64手提式高壓蒸汽消毒器：上海醫(yī)用核子儀器廠；WS2-134-75電熱恒溫培養(yǎng)箱：連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠；NDJ-8S數(shù)顯黏度儀：上海天平儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料制備

綠豆?jié){的制備：篩選無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉?fàn)€的飽滿綠豆，85℃在烘箱中干熱處理30 min，100℃沸水中熱燙5 min，鈍化脂肪氧化酶，減少豆腥味。處理后的綠豆與水按1∶5（g∶mL）料水比，40～50℃溫水中浸泡3 h，然后將綠豆打漿，漿液過(guò)80目篩，濾去粗渣，得到的綠豆粗漿，靜置12 h后再經(jīng)過(guò)離心分離（4 000 r/min，15 min）去除不溶性淀粉，得到綠豆?jié){[1，6-7]。

超微綠豆粉的制備：綠豆清洗干凈，熱風(fēng)風(fēng)干，碾壓后再擠壓膨化，膨化溫度為70～140℃，經(jīng)擠壓膨化后的綠豆用粗粉碎機(jī)粉碎至平均粒度＜100μm，隨后用超微粉碎機(jī)粉碎至平均粒度1～30μm[8-9]。

發(fā)酵劑的制備：將-80℃冷凍保藏菌株保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌分別接入裝有MRS培養(yǎng)基的試管中活化，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌42℃培養(yǎng)16 h，植物乳桿菌38℃培養(yǎng)14 h，培養(yǎng)好后將菌液逐級(jí)稀釋，調(diào)整培養(yǎng)液的菌濃度至106CFU/mL，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌按1∶1的比例以10%的接種量接入裝有牛奶培養(yǎng)基的三角瓶中，植物乳桿菌單獨(dú)以10%的接種量接入裝有牛奶培養(yǎng)基的三角瓶中，分別于42℃和38℃培養(yǎng)6 h。然后分別根據(jù)發(fā)酵劑用量以3%的接種量接入牛奶培養(yǎng)基中，分別于42℃和38℃培養(yǎng)4 h，制成常規(guī)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌酸奶發(fā)酵劑及植物乳桿菌發(fā)酵劑。

1.3.2 綠豆酸奶加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

配料：用過(guò)濾后檢驗(yàn)合格的鮮牛奶將一定量的白砂糖溶解，根據(jù)需要用過(guò)濾后檢驗(yàn)合格的鮮牛奶溶化綠豆?jié){、超微綠豆粉、穩(wěn)定劑，然后按一定比例與鮮牛奶混合。

預(yù)熱、均質(zhì)：將配料好的原料預(yù)熱到60℃，使用SLS-60高壓均質(zhì)機(jī)在壓力為15 MPa的條件下進(jìn)行均質(zhì)，均質(zhì)后于100℃瞬間滅菌。

冷卻：將滅菌后的原料冷卻到45℃。

接種：冷卻后在43～45℃按需要接種量進(jìn)行接種。

發(fā)酵：接種后根據(jù)需要在規(guī)定溫度下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間根據(jù)需要設(shè)定。

冷藏后熟：發(fā)酵結(jié)束后于4℃冷藏，后熟8 h。

1.3.3 綠豆酸奶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

在白砂糖添加量8%，常規(guī)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的酸奶發(fā)酵劑接種量3%，42℃發(fā)酵5 h的基礎(chǔ)上，依次考察綠豆?jié){添加量（10%、20%、30%、40%、50%）、超微綠豆粉添加量（1%、3%、5%、7%、9%）、白砂糖添加量（4%、6%、8%、10%、12%）、康海酸奶專用穩(wěn)定劑SA2C添加量（0.05%、0.15%、0.25%、0.35%、0.45%）、植物乳桿菌接種量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、常規(guī)酸奶發(fā)酵劑接種量（2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6%）、發(fā)酵溫度（36℃、38℃、40℃、42℃、44℃、46℃）、發(fā)酵時(shí)間（3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）對(duì)綠豆酸奶酸度、黏度、活菌數(shù)及感官評(píng)價(jià)的影響。

（2）正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以感官評(píng)分為考察指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)L9（34）優(yōu)化綠豆?jié){添加量（A）、超微綠豆粉添加量（B）、白砂糖添加量（C）、穩(wěn)定劑添加量（D），正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 綠豆酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for formula optimization of mung bean yogurt

1.3.4 測(cè)定方法

酸度測(cè)定[10]：按國(guó)標(biāo)GB5009.239—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》中的酚酞指示劑法；黏度測(cè)定[11-12]：采用黏度儀，取制備后冷藏過(guò)夜的酸奶樣品進(jìn)行測(cè)定。

活菌計(jì)數(shù)：取1 mL酸奶加入到含有9 mL滅菌生理鹽水且加入玻璃珠的三角瓶中，不停晃動(dòng)，將酸奶打勻，然后依次做10倍系列稀釋，選取三個(gè)適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)，吸取0.1 mL稀釋液涂計(jì)數(shù)培養(yǎng)基平皿，每個(gè)稀釋度做三個(gè)平行培養(yǎng)皿。倒置放入40℃恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48 h。選取菌落數(shù)在30～300之間的培養(yǎng)皿計(jì)菌落數(shù)[13]。

感官評(píng)價(jià)[14]：10位感官評(píng)價(jià)員，按國(guó)標(biāo)GB19302—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳》中凝固酸奶感官要求，對(duì)色澤、滋味和氣味、組織狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，每項(xiàng)滿分10分，滿分30分，取平均分。

各理化指標(biāo)檢測(cè)：脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、微生物指標(biāo)（乳酸菌數(shù)、大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、酵母、霉菌）均按照國(guó)標(biāo)GB 19302—2010《發(fā)酵乳》進(jìn)行檢測(cè)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆?jié){添加量對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表2 綠豆?jié){添加量對(duì)凝固型綠豆酸奶的影響Table 2 Effect of mung bean milk addition on the solidified mung bean yogurt

由表2可知，綠豆?jié){添加量在10%～50%范圍內(nèi)增加，凝固酸奶的酸度和黏度都會(huì)下降，酸度從85.6°T下降到68.5 °T，黏度從11.00 Pa·s下降到6.97 Pa·s，這有可能是因?yàn)殡S著綠豆?jié){添加量的增加，發(fā)酵原料中的干物質(zhì)比例減少，菌株可利用的轉(zhuǎn)化為乳酸和多糖的底物減少，故而降低了酸奶的酸度和黏度。隨著綠豆?jié){添加量的增加，綠豆酸奶的色澤和口感會(huì)越來(lái)越好，但組織狀態(tài)會(huì)越來(lái)越差，凝固不好，乳清增多。從感官評(píng)分來(lái)看，綠豆?jié){的添加量為30%時(shí)，感官評(píng)分最高，為23.9分，在此條件下，酸奶的酸度為78.5 °T，黏度為8.06 Pa·s，活菌數(shù)為1.02×108CFU/mL，完全滿足酸奶的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，綠豆?jié){的最佳添加量為30%。

2.2 超微綠豆粉添加量對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表3 超微綠豆粉添加量對(duì)凝固型綠豆酸奶的影響Table 3 Effect of ultrafine mung bean flour addition on the solidified mung bean yogurt

由表3可知，超微綠豆粉的添加量在1%～9%范圍內(nèi)增加，對(duì)酸奶的酸度和活菌數(shù)影響不大，酸度在85.0～86.8°T，活菌數(shù)在1.0×108CFU/mL左右。從感官評(píng)價(jià)來(lái)講，隨著超微綠豆粉添加量在1%～5%范圍內(nèi)增加，會(huì)使酸奶的綠豆風(fēng)味增強(qiáng)，但隨著超微綠豆粉干物質(zhì)的增加，也會(huì)使酸奶的黏度增加，硬度增大，影響酸奶的口感和組織狀態(tài)；當(dāng)超微綠豆粉添加量為5%時(shí)，酸度為85.0°T、黏度為12.82 Pa·s、活菌數(shù)為1.12×108CFU/mL、感官評(píng)分為24.2分；當(dāng)超微綠豆粉添加量＞5%之后，綠豆粉會(huì)在酸奶凝固過(guò)程中發(fā)生沉降，使綠豆粉與凝固乳分層，組織不均勻，外觀不好看，需加入穩(wěn)定劑改善分層現(xiàn)象。且感官評(píng)分從24.2降為22.4。因此，超微綠豆粉的添加量以5%為宜。

2.3 白砂糖添加量對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表4 白砂糖添加量對(duì)凝固型綠豆酸奶的影響Table 4 Effect of sugar addition on the solidified mung bean yogurt

由表4可知，白砂糖的添加量在4%～12%范圍內(nèi)增加，對(duì)酸奶的酸度、黏度和活菌數(shù)影響不大，酸度在84.2～85.2 °T，黏度在11.31～12.20 Pa·s，活菌數(shù)在1.11×108～1.25×108CFU/mL，差異可以忽略。從感官來(lái)講，白砂糖的添加量＜8%時(shí)，酸奶甜度不足，口味偏酸；白砂糖的添加量＞8%時(shí)，酸奶口感不協(xié)調(diào)，口味偏甜。因此，白砂糖的添加量以8%為宜。

2.4 穩(wěn)定劑添加量對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表5 穩(wěn)定劑添加量對(duì)凝固型綠豆酸奶的影響Table 5 Effect of stabilizer addition on the solidified mung bean yogurt

由表5可知，穩(wěn)定劑的添加量在0.05%～0.45%范圍內(nèi)增加，對(duì)酸奶的酸度和活菌數(shù)影響不大，酸度在79.6～80.8°T，活菌數(shù)在1.08×108～1.12×108CFU/mL。從黏度和感官評(píng)價(jià)來(lái)講，穩(wěn)定劑的添加量＜0.15%時(shí)，酸奶的穩(wěn)定性稍差，黏度為10.02 Pa·s；穩(wěn)定劑添加量＞0.15%時(shí)，隨著添加量的增加，酸奶的黏度增大，硬度增加，口感不爽滑、不協(xié)調(diào)。從酸奶的外觀看，0.15%的添加量即可改善綠豆酸奶添加超微綠豆粉后酸奶的分層現(xiàn)象。因此，穩(wěn)定劑的添加量以0.15%為宜。

2.5 植物乳桿菌接種量對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表6 植物乳桿菌接種量對(duì)凝固型綠豆酸奶質(zhì)量的影響Table 6 Effect of Lactob acillus plantarum inoculum on the solidified mung bean yogurt quality

由表6可知，在綠豆酸奶制備中，接種植物乳桿菌比僅使用常規(guī)酸奶發(fā)酵劑在活菌數(shù)及感官評(píng)價(jià)上都有提升，植物乳桿菌的接種量在0.5%～2.0%范圍內(nèi)增加，對(duì)酸奶的酸度和黏度影響不大，酸度在78.2～80.2°T，黏度在10.22～11.20 Pa·s，差異可以忽略。從活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)來(lái)講，植物乳桿菌的接種量＜1.5%時(shí)，活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)隨著接種量的增加而提升；植物乳桿菌的接種量＞1.5%時(shí)，與接種量1.5%相比，效果不明顯，活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)略有下降。植物乳桿菌的接種量為1.5%時(shí)，感官評(píng)價(jià)和活菌數(shù)最高，此時(shí)，酸奶質(zhì)地均勻、口感細(xì)膩、酸度適中。有可能為植物乳桿菌與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌協(xié)同作用，更有益于菌體對(duì)綠豆?fàn)I養(yǎng)成分的利用與轉(zhuǎn)化[16-17]。且植物乳桿菌在人體內(nèi)能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用在胃腸道內(nèi)占位、定植，抑制致病菌對(duì)胃腸道侵害，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，將其用于酸奶能夠起到益生菌的作用[18-20]。因此，綠豆酸奶可以在接種常規(guī)酸奶發(fā)酵劑基礎(chǔ)上再接種1.5%的植物乳桿菌發(fā)酵劑。

2.6 常規(guī)酸奶發(fā)酵劑接種量對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表7 常規(guī)酸奶發(fā)酵劑接種量對(duì)凝固型綠豆酸奶的影響Table 7 Effect of conventional yogurt starter inoculum on the solidified mung bean yogurt

由表7可知，接種量在2.0%～6.0%范圍內(nèi)增加，對(duì)酸奶的黏度影響不大，黏度在10.00～11.35 Pa·s，差異可以忽略，酸度隨著接種量的增加而升高。從活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)來(lái)講，接種量＜4.0%時(shí)，隨著接種量的增加，酸奶的活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)提高；接種量＞4.0%時(shí)，酸奶的活菌數(shù)和感官評(píng)價(jià)略有下降。因此，接種量以4.0%為宜。

2.7 發(fā)酵溫度對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表8 發(fā)酵溫度對(duì)凝固型綠豆酸奶的影響Table 8 Effect of fermentation temperature on the solidified mung bean yogurt

由表8可知，發(fā)酵溫度＜40℃時(shí)，酸度、黏度、活菌數(shù)和感官評(píng)分都比較低，酸奶稀薄，口感偏甜；當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，酸奶酸度、黏度適中，酸甜可口，活菌數(shù)最多，感官評(píng)分最高；發(fā)酵溫度＞40℃時(shí)，活菌數(shù)和感官評(píng)分都較40℃時(shí)低，且隨著溫度升高而降低，酸奶有乳清析出，酸甜不協(xié)調(diào)。因此，最佳發(fā)酵溫度為40℃。

2.8 發(fā)酵時(shí)間對(duì)綠豆酸奶質(zhì)量的影響

表9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)凝固型綠豆酸奶的影響Table 9 Effect of fermentation time on the solidified mung bean yogurt

由表9可知，發(fā)酵時(shí)間＜4 h時(shí)，酸度、黏度、活菌數(shù)和感官評(píng)分都比較低，酸奶稀薄，奶味濃，口味偏甜；發(fā)酵時(shí)間＞6 h時(shí)，酸度偏高，活菌數(shù)下降，口味偏酸，口感不好；從酸奶的組織狀態(tài)看，發(fā)酵時(shí)間5 h的酸奶均質(zhì)地均勻，細(xì)膩黏稠，僅有少量乳清析出，且酸奶酸甜可口，綠豆香味協(xié)調(diào)，感官評(píng)分最高。因此，發(fā)酵時(shí)間以5 h為宜。

2.9 綠豆酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)綠豆酸奶的發(fā)酵配方進(jìn)行優(yōu)化，接種常規(guī)酸奶發(fā)酵劑4.0%，接種植物乳桿菌1.5%，40℃發(fā)酵5 h，以感官評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表10。

表10 綠豆酸奶配方優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 10 Results and analysis of orthogonal experiments for formula optimization of mung bean yogurt

由表10可知，試驗(yàn)所選擇的各因素對(duì)結(jié)果影響效應(yīng)值大小為B＞C＞D＞A，即超微綠豆粉添加量對(duì)綠豆酸奶的影響最大，其對(duì)感官評(píng)分影響最明顯。綠豆酸奶的最佳配方組合為A2B3C2D1，即綠豆?jié){添加量30%，超微綠豆粉添加量為6%，白砂糖添加量為8%，穩(wěn)定劑添加量為0.10%。在此最佳配方條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，綠豆酸奶感官評(píng)分為28.2分。

2.1 0綠豆酸奶產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.1 0.1感官指標(biāo)

綠豆酸奶感官評(píng)分為28.2。色澤淡綠色，滋味和氣味良好，無(wú)異味，具有酸奶的奶香味和綠豆的清香味，凝乳均勻無(wú)分層或上清液析出，細(xì)膩無(wú)雜質(zhì)。

2.1 0.2理化指標(biāo)

蛋白質(zhì)含量為2.58 g/100 g，脂肪含量為2.5 g/100 g，酸度為81.2°T。

2.1 0.3微生物指標(biāo)

乳酸菌數(shù)為1.82×108CFU/mL，霉菌數(shù)＜10 CFU/mL，酵母數(shù)＜10 CFU/mL，未檢出大腸菌群、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌，符合GB 19302—2010《發(fā)酵乳》要求。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)化了凝固型綠豆酸奶的發(fā)酵工藝條件為綠豆?jié){添加量30%，超微綠豆粉添加量6%，白砂糖添加量8%，穩(wěn)定劑0.10%，發(fā)酵劑接種量為常規(guī)酸奶發(fā)酵劑4.0%、植物乳桿菌發(fā)酵劑1.5%，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間5 h。此條件下綠豆酸奶色澤均勻，呈淡綠色，酸甜適口，組織細(xì)膩絲滑，無(wú)乳清析出，有綠豆特有的清香味，感官評(píng)分為28.2分，酸度為81.2°T。理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。