褚志杰，張敬濤，馬艷，曹廣尚，白克運，楊培民

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)

結(jié)直腸癌(CRC)是消化道常見的惡性腫瘤。CRC的發(fā)病涉及正常黏膜上皮-異常隱窩灶-腺瘤-腺癌多個階段[1]。炎癥性腸病(IBD)與CRC關(guān)系密切，是CRC發(fā)病的一個重要原因，關(guān)于IBD-CRC的炎癥性癌變的動態(tài)演變過程的機制是目前的研究熱點。在IBD-CRC發(fā)病機制研究方面，由于腫瘤微環(huán)境在腫瘤增殖中起到核心作用，而體外模型缺少組織環(huán)境，因此采用體內(nèi)模型進(jìn)行研究非常必要。以往研究建立的模型主要為急性IBD模型、慢性IBD模型、CRC模型，研究內(nèi)容局限于腫瘤的某一特定階段，缺少對炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化階段的觀察。以誘變劑氧化偶氮甲烷(AOM)與致炎劑葡聚糖硫酸鈉(DSS)聯(lián)合使用建立的AOM/DSS小鼠模型，能夠模擬正常黏膜→炎癥→腫瘤生成的全過程，呈現(xiàn)急性炎癥的初期階段和較短的潛伏期；模型腫瘤位置多發(fā)于結(jié)腸遠(yuǎn)端，先以息肉狀生長，其病理學(xué)特征與人類CRC相似[2]，能夠反映人類由結(jié)腸炎癥進(jìn)展為腫瘤的發(fā)展模式。因此，AOM/DSS小鼠模型成為研究炎癌轉(zhuǎn)化的主要模型?，F(xiàn)將相關(guān)內(nèi)容綜述如下。

1 動物的選擇

1.1 品系 不同品系的小鼠對AOM/DSS的耐受性、敏感性存在差異，其原因可能為遺傳因素造成的黏膜抵抗炎性損傷能力的差異和(或)抑制炎癥反應(yīng)能力的差異[3]。Papanikolaou等[4]研究認(rèn)為，近交系小鼠A/J和SWR/J敏感性高，經(jīng)AOM反復(fù)腹腔注射后，最早可于第6周觀察到腫瘤形成；AKR/J小鼠則對AOM耐藥而不產(chǎn)生腫瘤。Suzuki等[5]報道4個近交系小鼠結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的敏感性順序為Balb/c>C57BL/6>C3H/HeN>DBA/2N，C3H/HeN和DBA/2N小鼠未發(fā)現(xiàn)腺癌。Melgar等[6]比較了Balb/c、C57BL/6兩種常用品系DSS結(jié)腸炎進(jìn)展的差異，使用DSS 1個周期后停藥，Balb/c小鼠結(jié)腸炎癥狀恢復(fù)，而C57BL/6小鼠炎癥反應(yīng)持續(xù)，結(jié)腸炎進(jìn)展為慢性期；認(rèn)為與Balb/c小鼠相比，C57BL/6小鼠對DSS的耐受力降低，炎癥過程持續(xù)時間長，最終由急性炎癥發(fā)展為慢性結(jié)腸炎。

隨著動物基因工程技術(shù)的發(fā)展，涌現(xiàn)出大量基因工程品系小鼠[7]，它們在天然的免疫活性結(jié)腸微環(huán)境中重現(xiàn)腺瘤或癌形成?；蚬こ绦∈蟊贿x擇性地敲除/敲入表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子、蛋白的基因，通過AOM/DSS給藥，觀察其與常規(guī)小鼠的差異，為疾病發(fā)病機制的研究提供了有力的工具[8]。Balb/c、C57BL/6、ICR-1為目前常用的小鼠品系，其中C57BL/6小鼠是首先完成基因組測序的小鼠品系，常用于建立轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為許多突變基因提供遺傳背景。C57BL/6小鼠用于構(gòu)建基因修飾動物模型，可以保證遺傳背景上的高度穩(wěn)定性和實驗數(shù)據(jù)的一致性，在AOM/DSS模型構(gòu)建中得到廣泛應(yīng)用。

1.2 雌雄 動物雌雄差異對研究結(jié)果的影響尚不明確，需要進(jìn)一步研究。綜合分析近年發(fā)表的多項關(guān)于AOM/DSS小鼠模型制備方案的文獻(xiàn)，結(jié)果顯示，雌雄小鼠均可受到AOM/DSS誘導(dǎo)，生成結(jié)直腸腫瘤[9,10]。Snider等[2]綜述了AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎相關(guān)癌癥小鼠模型，認(rèn)為盡管雌雄兩性小鼠都易受AOM/DSS誘導(dǎo)的CAC的影響，但根據(jù)作者的觀察，雌性小鼠傾向于產(chǎn)生更一致和可再現(xiàn)的結(jié)果。在觀察高脂飲食的影響時，通常選用雄性小鼠。Heijmans等[11]報道，在炎癥損傷的情況下，雌激素可促進(jìn)結(jié)腸炎相關(guān)腫瘤的發(fā)展。在人類中，激素替代療法增加了絕經(jīng)后婦女患潰瘍性結(jié)腸炎及相關(guān)疾病的風(fēng)險。Son等[9]觀察了雌二醇對不同性別ICR小鼠CRC腫瘤的影響，比較了不同取樣時間的結(jié)腸組織標(biāo)本中低程度惡性腺瘤、高度惡性腺瘤、癌癥有黏膜侵犯、癌癥與黏膜下層侵襲的腫瘤數(shù)量和腫瘤發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)雌性較雄性腫瘤數(shù)量減少、腫瘤發(fā)生率降低，腫瘤多樣性(即指不同發(fā)展程度的結(jié)腸腫瘤的分布情況)減少；在早期炎癥階段，雌二醇干預(yù)能抑制炎癥程度，減少腫瘤的發(fā)生。因此動物性別對研究的影響需要引起研究者的注意，建議根據(jù)研究目的選擇和明確動物的性別。

2 用藥方案

誘變劑AOM的活性代謝產(chǎn)物甲基氧化偶氮甲醇(MAM)通過膽汁和血液系統(tǒng)進(jìn)入腸道，在腸道中被腸道菌群水解酶分解為甲基碳正離子從而使DNA烷基化，誘發(fā)腫瘤生成。致炎劑DSS為化學(xué)致炎劑，通過破壞腸黏膜屏障引起腸道炎癥。一般認(rèn)為，AOM一次給藥配合DSS循環(huán)給藥即可獲得滿意的效果。

2.1 AOM的用藥方法 根據(jù)實驗室、小鼠環(huán)境設(shè)施和小鼠品系的差別，AOM給藥可以出現(xiàn)不同的效果。建議在野生型小鼠的3個不同隊列中使用3種不同劑量(7.5、10、12.5 mg/kg)進(jìn)行試驗。AOM的病死率通常在注射后24～72 h內(nèi)可觀察到[12]。

2.2 DSS的用藥方法

2.2.1 DSS的選擇 DSS是一種硫酸化多糖，具有很寬的分子量范圍(5～1 400 kDa)。不同分子量的DSS導(dǎo)致結(jié)腸炎和致癌的活性存在差異。5 kDa分子量的DSS處理的小鼠表現(xiàn)為較輕的結(jié)腸炎，在盲腸和升結(jié)腸中形成相對斑片狀的病變。500 kDa分子量的DSS無法通過腸道黏膜，經(jīng)其處理的小鼠在大腸中不形成病變，沒有誘導(dǎo)致癌活性。40 kDa分子量的DSS處理的Balb/c小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的結(jié)腸炎，適用于本模型研究[3]。另外DSS的來源也非常重要，不同廠家甚至不同批次的DSS可能產(chǎn)生顯著不同的結(jié)果。因此建議在每個實驗中使用同一制造商生產(chǎn)的同一批次。DSS溶液放置幾天后可能變得渾濁，建議2～3 d更換一次。

2.2.2 DSS的濃度與給藥時間 綜合多項關(guān)于AOM/DSS小鼠模型制備方案的文獻(xiàn)，各方案的DSS濃度與給藥時間并不一致[1，9,10]。Perse等[3]總結(jié)認(rèn)為，短期(4～9 d)連續(xù)給予2%～5% DSS可誘發(fā)急性結(jié)腸炎，臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、腹瀉、便秘潛血、豎毛、貧血，最終死亡。連續(xù)治療低濃度DSS或周期性給予DSS可能誘發(fā)慢性結(jié)腸炎。Suzuki等[13]對ICR雄性小鼠腹腔注射AOM 10 mg/kg后，分別給予0.5%、1%、2%的DSS飲用1周，于14周時處死動物；2%濃度組小鼠結(jié)腸管狀腺瘤發(fā)生率為100%(其中75%為腺癌)，1%濃度組腺瘤發(fā)生率為80%(其中60%為腺癌)，0.5%濃度組僅產(chǎn)生1個腺瘤；認(rèn)為DSS的腫瘤促進(jìn)作用呈劑量依賴性，要采用1%及以上濃度才能產(chǎn)生作用。

模型動物的結(jié)腸炎嚴(yán)重程度與DSS的負(fù)荷劑量相關(guān)。為了誘導(dǎo)可靠并且重復(fù)性好的結(jié)腸炎(以組織MPO的活性和組織病理變化為標(biāo)準(zhǔn))，DSS總攝取量需要超過30 mg/g體質(zhì)量的臨界負(fù)荷。一旦滿足該臨界負(fù)荷，DSS的攝入劑量的差異不會影響炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度[14]。

在DSS給藥期間，根據(jù)品系和基因型差異，小鼠體質(zhì)量可能明顯降低。停用DSS后，小鼠的體質(zhì)量會持續(xù)下降，疾病病理狀態(tài)評分有可能繼續(xù)升高。因此，采用高濃度的DSS溶液長時間給藥方案可能導(dǎo)致實驗過程難以控制，會造成實驗動物死亡。建議綜合考慮給藥濃度和給藥時間，計算動物負(fù)荷劑量，通過預(yù)實驗評估動物耐受力。如果小鼠體質(zhì)量減輕(相對于DSS給藥前1 d體質(zhì)量)達(dá)10%～20%，建議通過腹腔注射給予無菌鹽水(最多1 mL)或提供濕食物，以降低實驗動物病死率。如果小鼠體質(zhì)量減輕超過20%，表現(xiàn)出駝背姿勢或移動受限，那么可能需要對動物實施安樂死[12]。

2.2.3 給藥周期 停用DSS后，小鼠狀態(tài)一般2周內(nèi)可逐漸恢復(fù)狀態(tài)，反復(fù)刺激形成慢性炎癥表現(xiàn)。通過控制DSS給藥的持續(xù)時間和重復(fù)次數(shù)，可以加速腫瘤的形成。通常采取2.5%或更低的濃度與飲用水循環(huán)2次以上。匯總不同研究采用的給藥周期方案如表1所示。Angelou等[1]比較了不同給藥方案的病理發(fā)展階段，3% DSS 5 d、2.5% DSS 7 d，3個循環(huán)后，第84天時C57BL/6小鼠均表現(xiàn)為腺癌；而采用2.5% DSS 5 d、3個循環(huán)的方案，第60天小鼠表現(xiàn)為腺瘤，認(rèn)為該方案可作為誘導(dǎo)成腺瘤的適合方案。

3 動物病理狀態(tài)評估方法

3.1 疾病活動指數(shù)評分(DAI評分)方法 實驗過程中觀察并記錄小鼠的營養(yǎng)狀況、活動狀況、毛發(fā)、食欲、大便性狀、OB實驗結(jié)果等，定期稱量并記錄其體質(zhì)量，應(yīng)用體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)、大便性狀分?jǐn)?shù)、便血分?jǐn)?shù)三項均值的DAI評分進(jìn)行評價[2]。

3.2 結(jié)腸損傷及疾病發(fā)展程度評價 到實驗節(jié)點，麻醉后處死動物，獲取結(jié)直腸標(biāo)本，通過病理觀察來評價模型動物的結(jié)直腸炎癌轉(zhuǎn)化的階段和嚴(yán)重程度，是通常選用的方法。隨著時間的增加，實驗動物呈現(xiàn)出急性炎癥期、慢性炎癥期、腫瘤生成及發(fā)展的不同階段，在病理標(biāo)本中表現(xiàn)為“正常黏膜上皮→異常隱窩灶→微腺瘤→腺瘤→原位癌→侵襲性癌”的出現(xiàn)與程度差異。

炎癥向癌癥轉(zhuǎn)變的過程是一個連續(xù)的過程，如何評價中間狀態(tài)非常困難。評估不同病理類型的腫瘤發(fā)生數(shù)量和比例可反應(yīng)癌癥發(fā)生發(fā)展的程度。Son等[9]比較了不同取樣時間的低程度惡性腺瘤、高度惡性腺瘤、癌癥有黏膜侵犯、癌癥與黏膜下層侵襲的發(fā)病率來比較結(jié)腸標(biāo)本中腺瘤和癌癥的發(fā)生率和多樣性。Koerner等[10]比較了給藥后7、14、28、35、56 d的結(jié)腸腫瘤病變情況，通過半定量宏觀估計結(jié)直腸腫瘤(直徑≥2 mm的病變)的數(shù)量；基于炎癥嚴(yán)重程度、炎癥范圍、隱窩損傷和累及程度4個不同的參數(shù)來定義結(jié)腸切片的組織學(xué)評分；腫瘤分級采用病理切片HE染色結(jié)果，分為低程度異型增生、高程度異型增生、黏膜內(nèi)癌和腺癌，采用圖表直觀地展現(xiàn)出不同組別的發(fā)展程度差異。

染色方法的選擇也可能影響組織學(xué)觀察。在用Kreyberg-Jareg方法染色的切片中，隱窩炎、隱窩膿腫以及鱗狀上皮化比HE染色方法更容易診斷[3]。

3.3 體外檢查方法 AOM/DSS模型的構(gòu)建是個較為長期的過程，利用高分辨率、高靈敏度的成像手段，實現(xiàn)機體實時無創(chuàng)監(jiān)測，分析和判斷疾病進(jìn)程非常有意義。近年來，標(biāo)記物從單標(biāo)記發(fā)展到輔助標(biāo)記，再到雙標(biāo)記方法，成像方式出現(xiàn)了生物發(fā)光成像(BLI)、計算機斷層攝影(CT)、核磁共振成像(MRI)、正電子發(fā)射斷層攝影(PET)、熒光分子斷層攝影(FMT)和光學(xué)相干斷層攝影(OCT)的單用及聯(lián)用等，在監(jiān)測腫瘤生長、觀察腫瘤大小、量化腫瘤血管再生、分析腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機制方面取得進(jìn)展。

內(nèi)窺鏡檢查是一種無創(chuàng)的觀察方法。Kodani等[15]開發(fā)并驗證了可重復(fù)的內(nèi)窺鏡評分系統(tǒng)，該系統(tǒng)同時整合了炎癥和腫瘤的評估。內(nèi)窺鏡檢查建議在完成DSS給藥后1周進(jìn)行，不需要口服瀉藥清除結(jié)腸內(nèi)容物[12]。超聲生物顯微鏡與結(jié)腸鏡聯(lián)用來檢測結(jié)腸內(nèi)腫瘤，可分辨出0.1 mm的黏膜層凸起，降低了結(jié)腸鏡的誤診率，但無法區(qū)分病灶是否為良性或惡性[16]。共聚焦內(nèi)鏡可使圖像放大1 000倍，能夠在體實時顯示組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確鑒別正常、增生、瘤變的黏膜[17]。

4 腸道菌群

不同的飼養(yǎng)環(huán)境或不同批次的小鼠其腸道細(xì)菌微環(huán)境可能存在差異。研究表明，腸道菌群微環(huán)境與結(jié)腸炎癥的發(fā)展相關(guān)[18]。一方面，AOM在體內(nèi)需要腸道菌群相關(guān)酶的參與，才能轉(zhuǎn)化為具有烷基化作用的甲基碳正離子；另一方面，腸道菌群對維持機體免疫平衡具有重要作用，能夠調(diào)節(jié)DSS誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞損傷的敏感性和反應(yīng)性。幽門螺旋桿菌感染的小鼠由于腸道黏膜屏障功能下降，可出現(xiàn)更嚴(yán)重的炎癥癥狀，發(fā)生腺瘤的比例更高[19]。無菌條件下飼養(yǎng)的Balb/c和SCID小鼠，在DSS處理后僅發(fā)生黏膜炎癥的輕微跡象[20]。因此，為了盡可能獲得一致性的結(jié)果，建議使用同窩的小鼠；如果無法做到，強烈建議對照組和實驗組小鼠放到同一房間內(nèi)[12]。

5 動物模型與人類疾病的差異

在病理病理學(xué)變化方面，魯香鳳等[21]比較了人潰瘍性結(jié)腸炎(UC)與大鼠模型的組織病理學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)SD大鼠DSS模型早期病變始于固有膜下1/3隱窩萎縮消失，逐漸發(fā)展至全層隱窩消失，間質(zhì)以巨噬細(xì)胞為主，未見漿細(xì)胞，然后表面上皮變性壞死脫落、糜爛潰瘍形成，多個血管腔內(nèi)可見血栓，偶見機化，腺體不典型增生發(fā)生率低；而人UC早期病變始于表面上皮及上1/3隱窩急性炎，隱窩破壞萎縮與隱窩膿腫明顯相關(guān)，均伴慢性腸炎基礎(chǔ)病變及腺體不典型增生，偶見血栓伴/不伴機化。二者的共同點為大腸黏膜隱窩干細(xì)胞損傷，不同點為DSS首先損傷大鼠隱窩干細(xì)胞，繼發(fā)炎癥，而人UC則相反。

在基因及發(fā)病機制研究方面，人類CRC的組織病理學(xué)可檢測到β-連環(huán)蛋白、Kras或p53突變，在AOM/DSS小鼠模型可檢測到β-連環(huán)蛋白的突變，沒有檢測到Kras或p53的變；但單獨應(yīng)用AOM的大鼠模型可檢測到Kras突變[2]。在腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)研究方面，人類CRC患者在確診時區(qū)域淋巴結(jié)中約有50%的轉(zhuǎn)移率，但AOM/DSS誘導(dǎo)的小鼠模型腺癌轉(zhuǎn)移發(fā)生率低[22]。因此應(yīng)根據(jù)不同的研究目的選擇合適的動物模型。

6 結(jié)語

AOM/DSS誘導(dǎo)的結(jié)直腸炎癌轉(zhuǎn)化模型是研究結(jié)直腸腫瘤在炎癥環(huán)境中發(fā)展機制的有效工具。在病理學(xué)方面，從模型中收集的生物樣本可用于疾病的病理學(xué)分析、免疫浸潤和免疫組化研究，以探究潛在治療靶點、明確相關(guān)信號通路以及參與的特定免疫細(xì)胞組群；在基因組學(xué)方面，從模型中收集的生物樣本通過定量PCR和RNA測序、DNA序列分析等分子生物學(xué)技術(shù)可檢測相關(guān)基因表達(dá)，或應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡和其他蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行蛋白質(zhì)分析；在藥物治療學(xué)方面，該模型與潛在的治療方式、治療藥物聯(lián)合使用，可以明確和驗證新的治療靶點[2]。

AOM/DSS小鼠模型構(gòu)建易受到小鼠品系、飲食習(xí)慣、飼養(yǎng)環(huán)境的影響。本文匯總了近2年發(fā)表的文獻(xiàn)資料，在方案細(xì)節(jié)方面還存在一定的差異，有限的資料不能明確實驗動物的確切病理階段，尤其在異常隱窩生成到腺瘤生成的階段，目前的研究還不夠深入。建議在研究設(shè)計時應(yīng)給予注意，通過預(yù)實驗來明確影響程度，觀察動物病理學(xué)階段，減少實驗風(fēng)險。體外無創(chuàng)檢查和監(jiān)測方法的應(yīng)用為動物模型的連續(xù)性研究提供了更好的支持，為進(jìn)一步動態(tài)研究疾病發(fā)生及發(fā)展過程提供了更多的選擇方案。