項前，金培培，盧文斌，林省委，孟慶元，郭品豪，卞金俊

(海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院，上海200433)

黏附G蛋白偶聯(lián)受體(aGPCRs)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)家族成員之一。在迄今發(fā)現(xiàn)的800多個不同的GPCRs中，aGPCRs的結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，其包括不同功能蛋白域的嵌合組成，整合了細胞外細胞黏附功能與細胞內(nèi)GPCRs信號傳導(dǎo)功能[1]。aGPCRs分布廣泛，在免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生和許多發(fā)育過程中都起著重要作用[1～3]。巨噬細胞是一類重要的免疫細胞，既可作為抗原提呈細胞，又能釋放各種活性物質(zhì)間接或直接地參與各種炎癥反應(yīng)，其激活后產(chǎn)生的大量炎性因子可引起炎癥反應(yīng)失控，導(dǎo)致免疫功能紊亂[4]。部分aGPCRs表達于巨噬細胞表面，并對巨噬細胞的免疫功能具有一定的調(diào)節(jié)作用[5]，其中ADGRB1和ADREGE類成員與巨噬細胞的吞噬、白細胞活化和遷移等過程緊密相關(guān)[1]。然而，由于缺乏內(nèi)源性配體、產(chǎn)生的抗體活性未知和信號傳導(dǎo)途徑未識別等原因，對aGPCRs的研究受到阻礙。本文結(jié)合aGPCRs的分子結(jié)構(gòu)、激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，將aGPCRs在巨噬細胞中的作用研究進展綜述如下。

1 aGPCRs的分子結(jié)構(gòu)和激活、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制

1.1 aGPCRs的分子結(jié)構(gòu) aGPCRs可分為細胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)、7TM結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(ICD)[6]。aGPCRs與其他GPCRs家族成員不同，其通常存在300～6 000個殘基的異常大的ECD[5]。在ECD的N-末端半部，通常存在多種串聯(lián)的特征蛋白基序(即黏附蛋白基序)，如表皮生長因子(EGF)、免疫球蛋白(Ig)、正五聚蛋白(PTX)、血小板反應(yīng)蛋白(TSP)、富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRR)和凝集素樣結(jié)構(gòu)域，可促進細胞之間和基質(zhì)之間相互作用[5]。此外，這些結(jié)構(gòu)域在單個aGPCR中的組合復(fù)雜性形成了受體家族結(jié)構(gòu)和功能的高度多樣性。緊隨黏附蛋白基序的是一種新的自蛋白水解誘導(dǎo)(GAIN)結(jié)構(gòu)域，在大多數(shù)aGPCRs中它啟動獨特的翻譯后蛋白水解修飾[7]。GAIN由subdomain A和subdomain B組成。GPS水解位點是subdomain B的一部分。GAIN結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白水解被認為是在aGPCRs生物合成過程中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中發(fā)生，并且是通過在GPS保守的HL/T(S)序列上的一系列親核反應(yīng)自催化實現(xiàn)的[8]。

aGPCRs在GPS位點自發(fā)水解為N-端片段(NTF)和C-端片段(CTF)兩部分。研究發(fā)現(xiàn)，GPR56的整個ECD的更新結(jié)構(gòu)表征顯示GAIN結(jié)構(gòu)域包含一個只有三個螺旋的小subdomain A，但是高度保守的subdomain B，表明GAIN結(jié)構(gòu)域比原本認為的要更加多變[9]。此外值得注意的是，并非所有的aGPCRs都在GAIN區(qū)域可裂解，因為在它們的GPS內(nèi)缺乏一致的催化三元序列，這是自蛋白水解的先決條件[7]。目前關(guān)于GAIN結(jié)構(gòu)域自水解對受體功能的影響尚無明確結(jié)論。

1.2 aGPCRs的激活和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 靜息狀態(tài)下aGPCRs幾乎不提供任何信號。配體結(jié)合NTF或機械力都可以激活受體，導(dǎo)致G蛋白依賴性或非依賴性的信號傳導(dǎo)。被稱為Stachel的副膜系激動劑序列與CTF的結(jié)合證明在這些過程中起關(guān)鍵作用。aGPCRs也可以通過與同一細胞上的其他受體相互作用來介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

1.2.1 激活機制 有研究將aGPCRs歸入由整體激動劑激活的GPCRs組中[15]，而且發(fā)現(xiàn)來自GPS的C-端保守序列的肽能夠激活7TM[10]?；谝陨涎芯靠赏茰y，ECD內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，這種分子內(nèi)激動劑暴露于7TM結(jié)構(gòu)域或在7TM結(jié)合口袋內(nèi)異構(gòu)化，進一步啟動G蛋白激活[11]，這是aGPCRs的一個常見激活機制。見圖1。

研究顯示，細胞外配體的結(jié)合可誘導(dǎo)aGPCRs介導(dǎo)的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，Ⅳ型膠原和細胞朊病毒蛋白C可以在結(jié)合GPR126的N-端時誘導(dǎo)生成環(huán)磷酸腺苷(cAMP)[12]，進而激活蛋白激酶A(PKA)，調(diào)節(jié)靶細胞蛋白磷酸化。另有研究顯示，細胞振動可導(dǎo)致受體介導(dǎo)的cAMP形成[12]。提示aGPCRs可能作為代謝性機械傳感器[13]，在機械力驅(qū)動下發(fā)生激活。由此推測，自蛋白裂解的N-端的去除以及結(jié)合到細胞外基質(zhì)或鄰近細胞的N-端與aGPCRs表達細胞之間的相對運動均可導(dǎo)致受體激活。

上述研究表明，aGPCRs具有經(jīng)典GPCRs的許多特征，包括多重G蛋白偶聯(lián)能力、G蛋白獨立信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和副膜系激動作用，同時也具有信號整合、機械敏感性和通過其大ECD進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等新特性。

1.2.2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制 已知aGPCRs能夠激活G蛋白依賴和非依賴信號通路。G蛋白依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要代表為黏附G蛋白偶聯(lián)受體B1(ADGRB1)。BAI1通過7TM結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)尾部與ELMO、DOCK1和Rac形成三聚體復(fù)合物，介導(dǎo)巨噬細胞對凋亡細胞和革蘭氏陰性細菌的吞噬作用[14]。G蛋白非依賴性信號傳導(dǎo)也已為黏附家族其他成員證實。研究發(fā)現(xiàn)，CELSR1與Frizzled/Disheveled、DAAM1和PDZ-RhoGEF的直接串擾可導(dǎo)致肌動蛋白依賴性的平面極化收縮[15]。另外對GPR124[16]和GPR125[17]的研究顯示，Wnt/β-catenin通路和Wnt/平面細胞極性通路均參與了aGPCRs信號傳導(dǎo)。

近年來，aGPCR的去孤子化鑒定出許多單個aGPCR的內(nèi)源性和外源性結(jié)合配體[1]。這些配體中的大多數(shù)是細胞膜蛋白或細胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)類，此外多糖、脂肪酸和磷脂糖脂配體(如糖胺聚糖、PtdSer、LPS)也能結(jié)合特定aGPCRs[1,18]。雖然有限數(shù)量的配體能夠誘導(dǎo)aGPCRs信號，但迄今發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)配體似乎不能激活其同源aGPCRs。這個結(jié)果提示許多配體可能僅僅作為aGPCRs的結(jié)合配體，而沒有任何功能輸入。由于最近aGPCRs激活的所謂副膜系激動機制的揭示，新近的研究使得后者的解釋更加有說服力[10]。

2 aGPCRs在巨噬細胞中的作用

aGPCRs廣泛分布于大多數(shù)細胞類型和器官系統(tǒng)中，包括造血系統(tǒng)的細胞，而表達于巨噬細胞的主要有ADGRB1、ADGRE1、ADGRE2、ADGRE5、GPR116等[19]。這些aGPCRs通過不同的方面，對巨噬細胞的功能產(chǎn)生一定的調(diào)節(jié)作用。

2.1 ADGRB1 ADGRB1最初被鑒定為抗血管生成和抗腫瘤分子[20]，負責抑制血管生成的功能片段是其NTF的一部分。盡管其在大腦豐富表達[21]，但是ADGRB1蛋白不局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可見于單核細胞、巨噬細胞和胃上皮細胞[1]。ADGRB1的ECD由五個串聯(lián)排列的血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)序列(TSR)、一個HRM和一個RGD基序組成。每個TSR區(qū)域都具有不同的表面電荷分布，這導(dǎo)致不同的蛋白質(zhì)之間的偏向作用[1]，這個TSR區(qū)域在ADGRB1蛋白的免疫功能中起著關(guān)鍵作用。

ADGRB1是一種多功能分子，與許多內(nèi)源和外源配體結(jié)合。ADGRB1可以結(jié)合臨終細胞表面的PtdSer，在巨噬細胞中作為凋亡細胞的吞噬受體[22]。研究顯示，斑馬魚胚胎腦中的巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞利用ADGRB1控制垂死神經(jīng)元周圍吞噬體的形成和轉(zhuǎn)運[22]。ADGRB1介導(dǎo)的巨噬細胞清除凋亡細胞顯示出通過隨后產(chǎn)生抗炎介質(zhì)和調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)來促進抗炎反應(yīng)，其中部分通過上調(diào)ATP結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運體1(ABCA1)來實現(xiàn)[23]。類似地，ADGRB1介導(dǎo)的對結(jié)腸上皮凋亡細胞去除減輕了小鼠實驗性結(jié)腸炎中過度凋亡細胞引起的炎癥加重[14]。除了內(nèi)源性配體，ADGRB1還通過與LPS結(jié)合作為模式識別受體，介導(dǎo)巨噬細胞對革蘭陰性菌的吞噬作用。研究證明，ADGRB1通過Rac1激活的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶促進活性氧的產(chǎn)生，從而增強體內(nèi)巨噬細胞的殺菌活性[24]。

2.2 ADGRE1 鼠ADGRE1(F4/80)在巨噬細胞、CD8+髓樣樹突狀細胞、朗格漢斯細胞和嗜酸性粒細胞上均有表達[1]，是一種廣泛應(yīng)用于小鼠組織巨噬細胞的表面標記物[25]。最近，抗F4/80(mAb)及其衍生物被應(yīng)用于示蹤體內(nèi)組織特異性巨噬細胞并通過細胞靶向性抗細胞因子來治療巨噬細胞介導(dǎo)的自身免疫疾病[26]。然而在F4/80缺陷動物的巨噬細胞中并未發(fā)現(xiàn)明顯的表型改變，表明F4/80分子對于小白鼠的正常發(fā)育和成熟并非必需[27]。

2.3 ADGRE2 ADGRE2在單核細胞和巨噬細胞上高度表達[1]。研究發(fā)現(xiàn)，類風濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中ADGRE2表達高于對照組。在炎癥組織中，ADGRE2在巨噬細胞和中性粒細胞中的表達都有所增加。通過固定化2A1單抗激活A(yù)DGRE2可誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生促炎細胞因子，如白細胞介素8和腫瘤壞死因子[28]。這也可能成為類風濕關(guān)節(jié)炎治療的潛在研究途徑。

2.4 ADGRE5 ADGRE5在幾乎所有類型的髓樣細胞中均有表達，并且在某些自身免疫性疾病的巨噬細胞亞群中表達進一步上調(diào)，如類風濕關(guān)節(jié)炎滑膜中浸潤的巨噬細胞、高雪癥脾巨噬細胞和多發(fā)性硬化性腦病中的腦泡沫巨噬細胞[1]。有研究證明，給予小鼠ADGRE5中和單克隆抗體可改善小鼠膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，而且ADGRE5敲除的動物在兩種不同的類風濕關(guān)節(jié)炎動物模型中均顯示出疾病活動度降低[29]。這些都為ADGRE5在自身免疫病的治療中提供了可能的研究思路。

2.5 GPR116 GPR116也稱Ig-Hetpa，包含在其NTF中的有精子蛋白、腸激酶、agrin(SEA)結(jié)構(gòu)域和兩個Ig樣結(jié)構(gòu)域[59]。SEA結(jié)構(gòu)域是一個保守的獨立蛋白折疊結(jié)構(gòu)，能夠進行自蛋白水解裂解，類似于GAIN結(jié)構(gòu)域[30]。因此，GPR116在生物合成過程中經(jīng)歷兩種不同的自蛋白水解修飾事件，產(chǎn)生多個蛋白片段。最近對GPR116基因敲除小鼠的分析表明，GPR116在肺泡巨噬細胞的功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。GPR116缺陷小鼠的肺泡巨噬細胞顯示泡沫狀和被活化，導(dǎo)致肺局部炎癥和肺氣腫樣癥狀，推測可能是由于ROS和基質(zhì)金屬蛋白酶的生成增加所致[31]。

2.6 GPR97 雖然對GPR97在人單核巨噬細胞中的作用知之甚少，但在GPR97基因敲除小鼠中報道了小鼠GPR97在調(diào)節(jié)巨噬細胞炎癥中的潛在作用[32]。在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖模型中，GPR97缺乏導(dǎo)致肝臟和腎臟中浸潤的巨噬細胞數(shù)量增加，腫瘤壞死因子水平升高，以及白色脂肪組織中M1型與M2型巨噬細胞比例失衡。然而在此過程中，GPR97基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，其代謝功能并沒有顯著差異[32，33]。

綜上所述，aGPCRs不僅可作為巨噬細胞的表面標記并介導(dǎo)其吞噬作用，而且還可以誘導(dǎo)巨噬細胞釋放炎癥因子參與免疫過程。大量研究已經(jīng)證實，抑制巨噬細胞表面aGPCRs的表達或活性能有效減輕炎癥反應(yīng)和巨噬細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。因此，隨著對以巨噬細胞為靶點治療的免疫機制的深入研究，可以為炎癥性疾病的臨床治療與用藥提供新的思路和方法。