胡 棟，曹景盛，胡佳川，趙開謙，王金紀，常維山

（1.山東農業(yè)大學動物科技學院，山東 泰安 271000；2.山東省鄆城縣畜牧獸醫(yī)局，山東 鄆城 274700；3.山東省臨沂市瑞泰飼料有限公司，山東 臨沂 276000；4.山東中農普寧藥業(yè)有限公司，山東 泰安 271000）

中草藥中含有大量對生物機體有益生物的大分子物質，這些大分子物質可對機體的免疫水平和內環(huán)境起到顯著的改善作用，但這些大分子物質通常在進入機體后不易被分解利用，而生物發(fā)酵是利用益生菌的發(fā)酵作用將中草藥中的大分子物質轉變?yōu)闄C體腸道較易吸收的活性小分子物質，從而最大限度地發(fā)揮中草藥的藥理作用[1-2]?，F代微生物發(fā)酵技術是在較為溫和的條件下進行生物轉換，最大限度地保證中草藥的生物活性物質不受到破壞，相比傳統中草藥生產具有快速、經濟、便捷和最大限度保護中草藥的生物活性成分等優(yōu)勢[3-4]。

1 中草藥發(fā)酵的歷史與現狀

傳統中草藥發(fā)酵是將大量未知菌種與藥材混合進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中由于菌種不純和溫度、酸堿度或需氧量等較難控制從而使得發(fā)酵效果不理想并且發(fā)酵效率較低，發(fā)酵后提純物質的生物活性不高，這極大限制了微生物發(fā)酵的作用。另外，各個菌種之間是否會發(fā)生互作而產生有害物質也不能明確。種種原因使得傳統中草藥發(fā)酵技術無法有效分解中草藥的有效成分。在此背景下，現代中草藥發(fā)酵技術作為一種新型發(fā)酵技術被發(fā)現并且不斷被推廣利用。

20世紀90年代，莊易等提出了利用藥用真菌發(fā)酵為模型的新型固體發(fā)酵工程，即以藥用真菌特定的充分分解轉化中草藥，達到兩者有機結合的目的[5]。該方法是利用真菌自身發(fā)酵的原理產生次生代謝產物，例如靈芝菌絲體、冬蟲夏草菌絲體等較為單一的純種發(fā)酵。之后，真菌自身分解發(fā)酵成為了新型的研究熱點，一大批關于靈芝、冬蟲夏草、云芝、甘草、雷公藤等自身發(fā)酵的研究不斷被報道出來。此外，有研究通過在培養(yǎng)基中添加適量的中草藥物來共同發(fā)酵，利用真菌對中草藥獨特的分解、異生能力來轉化中草藥中的大分子物質，提高發(fā)酵中草藥的藥效，并新生大批具有獨特生物活性的新型物質。研究表明，多種益生菌相互混合發(fā)酵的研究必將成為未來研究的新熱點。

國外對于中草藥發(fā)酵的相關研究報道較少，且主要集中在食品開發(fā)和酶系工程，例如日本的納豆，則用枯草芽孢桿菌來發(fā)酵大豆。由于枯草芽孢桿菌分泌包括淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶等豐富的酶系，并可促進對植物中維生素K的釋放。中草藥發(fā)酵的研究有必要借鑒上述成功經驗。

2 中草藥發(fā)酵的分類

現代中草藥發(fā)酵技術是以傳統中草藥發(fā)酵炮制方法為基礎，并吸取了現代新型技術的創(chuàng)新而形成的新技術。根據發(fā)酵培養(yǎng)基的不同，現代中草藥發(fā)酵從形態(tài)上可分為液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩大類[6]。

液體發(fā)酵，又稱為液體深層發(fā)酵，是在融合了抗生素制作工藝的基礎上發(fā)展起來的，液體發(fā)酵是將菌絲與培養(yǎng)基和中草藥混合在一起，置于合適的溫度中發(fā)酵，其發(fā)酵產物包括菌絲體及發(fā)酵液中的采集代謝產物[7]。液體發(fā)酵具有效率高、操作簡便和成本低的特點，且較容易實現自動化生產，所以液體發(fā)酵是未來現代發(fā)酵中草藥大規(guī)模生產的首選方式[8]。

固體發(fā)酵是以古代的制曲工藝為基礎，以富含營養(yǎng)成分的農副產品為營養(yǎng)基質，采用一種或多種菌作為發(fā)酵菌種，在特定的條件下進行發(fā)酵[9]。其發(fā)酵自然開放，基質不滅菌。雖然固體發(fā)酵在產物生成量上不低于深層發(fā)酵，但是其生產工藝存在一定的局限性，例如，機械化程度低、難以大規(guī)模生產、發(fā)酵速度慢、產量低、且發(fā)酵過程難以控制，發(fā)酵終點難以掌握，并且質量控制標準繁多和產品處理后工藝較為復雜等[10]。

3 中草藥發(fā)酵的優(yōu)勢

3.1 保護中草藥活性成分免受破壞

微生物發(fā)酵相對于傳統中草藥發(fā)酵的特點是作用條件較為溫和，生長代謝速度較快和生物轉化效率較高等，以上特點避免了中草藥在發(fā)酵過程中因受到其他影響而使生物活性物質遭到破壞，特別是對熱比較敏感的芳香類揮發(fā)油、蛋白質、維生素、氨基酸、微量元素等活性成分，也包括薄荷和當歸等中草藥，也避免了傳統中草藥由于煎、煮、熬、煉、蒸、浸等加工工藝對生物活性物質的破壞[11-12]。

3.2 提高發(fā)酵效率

發(fā)酵過程中微生物可以特異性地產生專一性酶修飾中草藥的結構，同一些化學反應相比，中草藥發(fā)酵的條件較為簡單、專一、安全、經濟等，并可對一些結構較為復雜的化合物進行特定的氧化還原反應；益生菌在培養(yǎng)基中的生長過程中可大量釋放胞外酶，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和淀粉酶等，這些酶或可分解植物細胞壁中纖維素、果膠質、半纖維素和木質素等致密結構，促進植物細胞中活性物質的釋放，可提高飼料的轉化率，減少對環(huán)境的污染，可對一些生物活性大分子物質進行修飾，獲得一些空間結構更穩(wěn)定或生物活性更高的新物質[13]?，F代發(fā)酵技術是實現中草藥現代化的重要途徑，是融合了高科技水平與傳統發(fā)酵的新型制備工藝，而且生產操作簡單，所得發(fā)酵產物精確，制劑也方便，更利于實現量產。研究發(fā)現，黃芪采用發(fā)酵方法提取的黃芪多糖量是傳統藥煎法提取量的1 000%～2 000%[14-15]。

3.3 降低中毒副作用

益生菌可顯著分解中草藥發(fā)酵過程中的有毒物質，從而顯著降低藥物使用的毒副作用。大黃生用瀉下作用劇烈，較易引發(fā)腹痛、惡心等反應。大黃瀉下的直接作用的是結合型蒽醌衍生物，其中以二蒽醌番瀉苷為功能最強烈的成分，在以往中醫(yī)臨床中，為了緩和大黃的瀉下作用和對胃腸道的不良反應，常采取不同方法對進行炮制，分解或破壞結合型蒽醌，緩解其對機體的毒副作用。而采用現代發(fā)酵方法對大黃進行炮制，則大大提高了蒽醌類物質的提取量，并顯著改善瀉下和對胃腸道的不良反應[16]。例如用酵母對蒽醌類成分進行發(fā)酵后，總蒽醌含量顯著提高，而主要起瀉下作用的結合型蒽醌含量明顯降低。此外，作為抗菌、抗病毒的主要效應成分的游離型蒽醌的含量則提高了600%，減毒增效的作用大大增強。中草藥發(fā)酵可通過微生物的轉化作用將有毒物質分解，或者修飾藥材中的毒性成分，從而使其毒性逐漸降低或者徹底消除[17]。

3.4 產生新活性物質

益生菌在培養(yǎng)基中進行發(fā)酵的過程中，藥物釋放的某些成分或可對微生物的生長和代謝起到一定的促進作用，使益生菌在發(fā)酵中草藥培養(yǎng)基中的特殊環(huán)境中改變了自身的代謝途徑從而產生一系列豐富的初生或次生代謝產物，有些代謝產物可對機體產生功效良好的藥物，此外，以中草藥一些成分為前體，經酯化、氧化、葡萄糖基化、異構化、甲基化、去甲基化、乙?；榷喾N生物轉化途徑，可生成新的化合物[18]。利用枯草芽孢桿菌對三七根進行發(fā)酵后，人參皂苷RH4開始進入人們的視線[19]。在以往的炮制過程中，人參皂苷RH4從未被發(fā)現，這說明微生物轉化可產生新型物質，究其原因可能是在發(fā)酵時三七須根的某些皂苷被微生物轉化為人參皂苷RH4，此為現代發(fā)酵產生新活性物質提供重要參考依據[20]。

4 中草藥發(fā)酵的關鍵技術

4.1 篩選適合發(fā)酵的中藥

中草藥作為發(fā)酵的基本原料，包括單味中草藥或復方中草藥，而篩選針對具有特定活性功能的發(fā)酵中草藥是發(fā)展中草藥發(fā)酵制劑的技術基礎[21]。研究證明，連翹等中草藥的發(fā)酵產物有較好的抑菌效果，而苦參等發(fā)酵產物的抑菌效果則較低，其他中草藥的發(fā)酵產物未見有抑菌能力[22-23]。不是所有的中草藥經過發(fā)酵后均可抑制病菌，篩選開發(fā)合適的中草藥和發(fā)酵方法，應選擇合適的原料和條件才能發(fā)揮其應有的效果。

4.2 選育優(yōu)良發(fā)酵菌種

采取優(yōu)良菌種進行發(fā)酵是現代發(fā)酵中草藥的關鍵。微生物的多樣性為現代中草藥發(fā)酵提供豐富的可供選擇的菌種，每種微生物具有不同的生物特性，在中草藥發(fā)酵中可發(fā)揮出不同的效果[24]。真菌具有種類繁多、次級代謝產物豐富、培養(yǎng)環(huán)境較為簡單等特點，并且可以產生促進分解纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等大分子物質的活性酶，這些特點決定了真菌強大的分解代謝能力，為現代發(fā)酵中草藥提供了一種新型的思路。

傳統發(fā)酵中草藥中利用的菌種多為自然菌，比如中草藥淡豆豉，用純種細菌發(fā)酵淡豆豉，以染料木素和大豆黃素為指標檢測主要發(fā)酵后的有效成分后，純種細菌發(fā)酵可以保證淡豆豉生產的穩(wěn)定性和產量的提高。而目前發(fā)酵中草藥一般采取單一菌種純種發(fā)酵。除了在日常中篩選具有優(yōu)良發(fā)酵能力的自然菌種外，還可利用實驗室方法對菌種進行改進，例如物理化學方法的誘導技術、原生質體融合技術、基因工程技術等方法。

4.3 優(yōu)化中藥發(fā)酵條件

為了使發(fā)酵菌種的轉化能力得到提升，獲得更多的目標產物，應著重優(yōu)化培養(yǎng)基的培養(yǎng)環(huán)境和培養(yǎng)比例，制定更科學的發(fā)酵工藝。不同物質中的纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等大分子物質的含量差異性較大，篩選合適的菌種、培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境等成為現代發(fā)酵技術的一項先遣條件，只有進行最合適的發(fā)酵工藝，才能最大限度的利用培養(yǎng)基中的中草藥成分，釋放和產生更多的生物活性成分。

4.4 活性成分與藥理模型篩選

中草藥本身的成分和結構相當復雜，而中草藥在機體內的藥理作用更是涉及多成分、多靶點、多途徑作用的一個過程，另外包括發(fā)酵過程中微生物生長特性的多樣性及發(fā)酵后產生的多種新型化合物，使得從復雜的發(fā)酵產物中提取出可以利用的活性物質成為現代發(fā)酵中草藥的關鍵點。合理的藥理模型有助于對發(fā)酵產物中有效成分的篩選和提取，并且是建立中草藥多靶點作用模式的重要保障。相關研究證明，苷類中草藥需在機體腸道內經過其中的微生物發(fā)酵作用后轉化為苷元后才具有藥效。通過外部模擬腸道內的環(huán)境，并且利用微生物將原型藥物苷轉化為能夠被機體快速吸收利用的苷元，為進一步提高苷元活性成分的生物利用度和苷元的產量提供了新的思路和方法。相關數據證明，建立體外模型將藥材中苷類成分轉化為具有生物活性的苷元，過程簡單，成本低廉，更可將中間體開發(fā)為新劑型，并且符合現代中草藥發(fā)酵的客觀要求。

5 小結與展望

現代發(fā)酵工藝在基礎理論和研究階段都處在起步階段，特別是對復方中草藥的研究內容還很少，能夠量產和被市場利用的發(fā)酵新藥仍較少[25]。研究發(fā)現，現代發(fā)酵工藝面臨一些較為嚴峻的問題，如中草藥自身體系的不確定性、中草藥原料本身所含成分的復雜性、中草藥發(fā)酵機理研究不夠深入、微生物生長特性的多樣性及在中草藥活性成分的不明確性等都限制著發(fā)酵中草藥的進一步發(fā)展。因此，還需進一步完善和優(yōu)化現代發(fā)酵工藝，例如優(yōu)良菌種的選育和純化、多種微生物復合發(fā)酵工藝的研究運用、發(fā)酵機理的研究過程、發(fā)酵中草藥如何進行篩選和多維評價體系的設立等方面。我國在中草藥方面的利用經歷了中醫(yī)幾千年的實踐累積和歷史沉淀，在具體的應用中是非常占有優(yōu)勢的，所以不僅要繼續(xù)發(fā)揚中醫(yī)勇于探索的精神，還要繼承這些優(yōu)越的技術，將其和現代科學技術充分結合起來，進一步分析其原理，探索其規(guī)律，繼而推廣到不同的中草藥中。當前，我國畜牧業(yè)的抗生素的亂用和其藥物殘留問題嚴重制約著畜牧業(yè)的健康快速發(fā)展，而發(fā)酵中草藥具有“高效、量少、安全”等特點和優(yōu)勢。中草藥原料經過微生物的充分發(fā)酵后可釋放大量的生物活性物質來提高中草藥的藥效，降低其使用量，另一方面微生物所產的部分酶系可以幫助動物快速消化飼料，促進營養(yǎng)物質的吸收利用[26-28]。不同學科之間的交叉發(fā)展和發(fā)酵技術的進一步成熟，必將進一步推動現代中草藥發(fā)酵工藝技術的研究，從而加強中草藥資源的可持續(xù)利用與中醫(yī)藥現代化的早日實現。