王 洪，戴方偉，王 靜，魏 杰，杜江濤，黃樹(shù)武，賈松華，岳秉飛*

(1. 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629；2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州 310013；3. 廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所，廣州 510663)

微衛(wèi)星(microsatellites)，也叫做短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeat，STR)。該序列由2～6 bp的核心序列和相對(duì)保守的側(cè)翼序列組成。根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增結(jié)果能夠反映出不同品系或不同個(gè)體的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的核心序列重復(fù)個(gè)數(shù)的差異。對(duì)不同品系或不同群體在微衛(wèi)星核心序列上的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獲取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳背景信息。參照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 14923-2010[1]，“可選用DNA多態(tài)性檢測(cè)法進(jìn)行群體遺傳質(zhì)量檢測(cè)”。我們國(guó)家的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14927.1-2008[2]仍采用生化標(biāo)記檢測(cè)法，而美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室和Charles River實(shí)驗(yàn)室均采用微衛(wèi)星標(biāo)記以及SNP標(biāo)記等分子生物學(xué)方法[3-4]。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制是所有其他質(zhì)量控制的基礎(chǔ)，只有在遺傳質(zhì)量滿足標(biāo)準(zhǔn)要求的前提下，其他方面的質(zhì)量控制才有意義。為了滿足送檢單位的需求，提升檢測(cè)能力，滿足國(guó)際合作與交流的需要，急需建立微衛(wèi)星標(biāo)記方法的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制提供檢測(cè)依據(jù)。本研究針對(duì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[5]中微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)法，在3家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行方法驗(yàn)證，證實(shí)該方法能否用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)，在不同的實(shí)驗(yàn)室是否具有較好的重復(fù)性[6]。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6只C57BL/6J實(shí)驗(yàn)小鼠，SPF級(jí)，8周齡，雌雄各半，體重20～22 g，來(lái)源于國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心[SCXK (京) 2014-0013]。小鼠取材于中國(guó)食品藥品檢定研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施[SYXK (京) 2016-0004]，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

Tris飽和酚，氯仿，異戊醇，采購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Takara HS Taq 酶(R007B)，100 bp DNA ladder(3422A)，DL500 DNA marker購(gòu)自TaKaRa(A701A和A801C)，瓊脂糖(5260)和6× loading buffer(A6101)均購(gòu)自北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司。所用PCR儀為美國(guó)ABI VeritiTM96；微量分光光度計(jì)為美國(guó)Thermo Nanodrop 2000；凝膠成像系統(tǒng)為美國(guó)Kodak GL212Pro；基因測(cè)序儀ABI3730xl。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)選取

本研究隨機(jī)選取團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[5]中12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，所用引物信息見(jiàn)表1。

1.3.2 模板DNA提取[7]

實(shí)驗(yàn)小鼠尾尖組織樣本5 mm，用酚/氯仿抽提法提取基因組DNA。經(jīng)微量分光光度計(jì)檢測(cè)，將所有DNA濃度均稀釋為50 ng/μL。

1.3.3 PCR體系和反應(yīng)條件[7]

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中含10× PCR buffer：2 μL，上下游引物(10 pmol/μL)：各1 μL，dNTP(100 μmol/L)：1.2 μL，Taq酶(5 U/μL)：1 μL，50 ng/μL基因組DNA：1 μL，鎂離子終濃度1.5 mmol/L，無(wú)菌蒸餾水補(bǔ)齊20 μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性, 5 min；94℃變性，30 s；退火溫度(見(jiàn)表1)，30 s；72℃延伸，30 s；35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸8 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，30 min。

分別位于北京、浙江、廣東的3家實(shí)驗(yàn)室用同樣的12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)6份實(shí)驗(yàn)小鼠DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳。北京實(shí)驗(yàn)室電泳使用100 bp DNA ladder,浙江和廣東實(shí)驗(yàn)室電泳使用DL500 DNA marker。

1.3.4 測(cè)序[7]

對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行STR掃描測(cè)序。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所用軟件POPGENE 1.32和PIC Calc 0.6。

2 結(jié)果

北京、浙江和廣東的3家實(shí)驗(yàn)室分別獲得清晰電泳條帶，獲得等位基因數(shù)72個(gè)。其中D16Mit9位點(diǎn)在6只C57BL/6 J小鼠獲得一致的143 bp的等位基因片段。D12Nds11位點(diǎn)在6只C57BL/6 J小鼠獲得一致的174 bp的等位基因片段。詳見(jiàn)圖1A～1F，圖2A～2F和圖3A～3F測(cè)序結(jié)果表明3家實(shí)驗(yàn)室獲得片段大小一致的等位基因。12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在6只實(shí)驗(yàn)小鼠的等位基因片段長(zhǎng)度見(jiàn)表2。

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)法是國(guó)內(nèi)外通用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)手段。國(guó)外實(shí)驗(yàn)室對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量的控制主要采取微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測(cè)法和SNP方法[8-9]，為滿足國(guó)際合作與交流的需要，本研究驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)室建立的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用的可行性以及可重復(fù)性。

基于微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)法的重要性，近些年來(lái)，已有科研人員在微衛(wèi)星方法的建立及應(yīng)用方面開(kāi)展過(guò)一些研究。周建華等人[10]采用14個(gè)微衛(wèi)星DNA標(biāo)記技術(shù)對(duì)福建獼猴與河南獼猴遺傳多樣性進(jìn)行分析。劉麗等人[11]利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，分析祁連山東段高寒草甸區(qū)小尺度下4個(gè)高原鼢鼠種群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。衛(wèi)振等人[12]從400對(duì)微衛(wèi)星引物中篩選得到51對(duì)分辨率高的引物用于豚鼠的常規(guī)檢測(cè)研究。李銀銀等人[13]利用30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)國(guó)內(nèi)24個(gè)近交系實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行遺傳狀況分析。范濤等人[14]應(yīng)用30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)4種不同來(lái)源高度免疫缺陷小鼠微衛(wèi)星DNA 遺傳檢測(cè)的分析。郭羽等人[15]應(yīng)用微衛(wèi)星技術(shù)對(duì)兩個(gè)來(lái)源的NIH實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。微衛(wèi)星技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系鑒定和群體結(jié)構(gòu)分析方面應(yīng)用廣泛。

但是之前建立的方法，沒(méi)有進(jìn)行方法重復(fù)性研究，極大地限制了微衛(wèi)星方法在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量控制方面的應(yīng)用。本研究側(cè)重于微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)法在3家實(shí)驗(yàn)室的重復(fù)性研究。選擇位于北京，浙江和廣東的3家實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)6只實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行遺傳質(zhì)量檢測(cè)，研究結(jié)果表明，擴(kuò)增條帶與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定一致，微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)，并在不同實(shí)驗(yàn)室獲得較好的重復(fù)性。本研究成果豐富了我國(guó)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)手段，為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[5]升級(jí)為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供合理依據(jù)，保障國(guó)際交流與合作的順利開(kāi)展。

表2 6只小鼠在12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因片段大小Table 2 Length of alleles of the six mice using 12 microsatellites

注：A：D16Mit9位點(diǎn)電泳結(jié)果；B：D12Nds11位點(diǎn)電泳結(jié)果；C：小鼠樣本1～3的D16Mit9位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；D：小鼠樣本4～6的D16Mit9位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；E：小鼠樣本1～3的D12Nds11位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；F：小鼠樣本4～6的D12Nds11位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。圖1 北京實(shí)驗(yàn)室在D16Mit9和D12Nds11位點(diǎn)電泳結(jié)果圖和測(cè)序結(jié)果圖Note. A: Electrophoresis result of D16Mit9; B: Electrophoresis result of D12Nds11; C: Sequencing result of D16Mit9 in samples 1-3; D: Sequencing result of D16Mit9 in samples 4-6; E: Sequencing result of D12Nds11 in samples 1-3; F: Sequencing result of D12Nds11 in samples 4-6.Figure 1 Electrophoresis images and sequencing results of D16Mit9 and D12Nds11 in the Beijing laboratory

注：A：D16Mit9位點(diǎn)電泳結(jié)果；B：D12Nds11位點(diǎn)電泳結(jié)果；C：小鼠樣本1～3的D16Mit9位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；D：小鼠樣本4～6的D16Mit9位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；E：小鼠樣本1～3的D12Nds11位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；F：小鼠樣本4～6的D12Nds11位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。圖2 浙江實(shí)驗(yàn)室在D16Mit9和D12Nds11位點(diǎn)電泳結(jié)果圖和測(cè)序結(jié)果圖Note. A: Electrophoresis result of D16Mit9; B: Electrophoresis result of D12Nds11; C: Sequencing result of D16Mit9 in samples 1-3; D: Sequencing result of D16Mit9 in samples 4-6; E: Sequencing result of D12Nds11 in samples 1-3; F: Sequencing result of D12Nds11 in samples 4-6.Figure 2 Electrophoresis images and sequencing results of D16Mit9 and D12Nds11 in the Zhejiang laboratory

注：A：D16Mit9位點(diǎn)電泳結(jié)果；B：D12Nds11位點(diǎn)電泳結(jié)果；C：小鼠樣本1～3的D16Mit9位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；D：小鼠樣本4～6的D16Mit9位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；E：小鼠樣本1～3的D12Nds11位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果；F：小鼠樣本4～6的D12Nds11位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。圖3 廣東實(shí)驗(yàn)室在D16Mit9和D12Nds11位點(diǎn)電泳結(jié)果圖和測(cè)序結(jié)果圖Note. A: Electrophoresis result of D16Mit9; B: Electrophoresis result of D12Nds11; C: Sequencing result of D16Mit9 in samples 1-3; D: Sequencing result of D16Mit9 in samples 4-6; E: Sequencing result of D12Nds11 in samples 1-3; F: Sequencing result of D12Nds11 in samples 4-6.Figure 3 Electrophoresis images and sequencing results of D16Mit9 and D12Nds11 in the Guangdong laboratory