龔阿芳，李銀生

(1. 鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 450064；2. 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

全氟辛烷磺酸鹽(perfluorooctane sulfonate，PFOS)作為重要的全氟化表面活性劑，廣泛應(yīng)用于殺蟲劑、滅火劑、紙張等日常生活用品生產(chǎn)[1-2]。由于PFOS在人體的的蓄積率較高，目前在人體血清、臍帶血、乳汁中均能檢測到PFOS的存在，特別是青少年人群蓄積嚴(yán)重[3]。前期毒理學(xué)研究顯示，PFOS對(duì)肝、神經(jīng)生殖、心血管和生殖發(fā)育均有顯著的毒性作用[4-7]。研究顯示，肝是PFOS毒力的主要靶器官，影響脂肪代謝，越過胎盤屏障，危害子代健康[8-9]。糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid，GC)，簡稱皮質(zhì)醇，是一類甾體激素。研究認(rèn)為，GC在胎兒的生長發(fā)育過程中有著重要作用，GC既可以在細(xì)胞水平影響受體、酶、離子通道和載體，也能調(diào)控細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、連接蛋白和信號(hào)途徑以及不同生長因子的表達(dá)，GC水平過高還能抑制蛋白質(zhì)合成，甚至導(dǎo)致生長停滯，胎兒宮內(nèi)GC過高會(huì)對(duì)子代的生長發(fā)育產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響[10-12]。

本研究通過不同劑量PFOS對(duì)孕鼠的染毒處理，檢測孕鼠和胎鼠的各項(xiàng)生理生化指標(biāo)、孕鼠血清PFOS蓄積、GC含量、胎盤胰島素樣生長因子((insulin-like growth factor 1，IGF-1)的變化，以期為PFOS導(dǎo)致的胎兒的生長異常研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年雌性SD大鼠48只(孕11 d)，體質(zhì)量240～280 g，購自第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK (渝) 2015-0005]。飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房[SYXK(豫)2017-022]，飼養(yǎng)條件：室溫20℃～24℃，相對(duì)濕度40%～70%，光暗循環(huán)12 h/12 h，自由飲水?dāng)z食。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查號(hào)：2017062302。

1.2 主要試劑與儀器

全氟辛烷磺酸鉀(H2012067，99.00%分析純，美國Sigma公司)；Tween 20(H2017231，Sigma-Aldrich，美國)；RT-PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；RT-PCR引物由上海英維捷基貿(mào)易有限公司合成；血清糖皮質(zhì)激素ELISA試劑盒(S2018031，武漢華美生物技術(shù)公司)；RNA提取試劑盒(S2017023，美國Omega公司)。全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio-Rad iMark，美國)；冷凍離心機(jī)(Eppendorf Microfuge 20R，德國)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(StepOne，美國ABI公司)；5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(AB SCIEX公司)；ZorbaxXDB C-18色譜柱(Narrow Agilent，美國)；低溫冰箱(Thermo Scientific Forma，美國)；電子天平(Sartorious公司，德國)；手動(dòng)式超聲波細(xì)胞破碎儀(Thermo公司，美國)；Milli-Q超純水儀(Millipore公司)；XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組和染毒

隨機(jī)分為4組，對(duì)照組(0.5%體積分?jǐn)?shù)的Tween 20)，低劑量染毒組(5 mg/kg PFOS)、中劑量染毒組(10 mg/kg PFOS)和高劑量染毒組(20 mg/kg PFOS)，每組12只。染毒組SD孕鼠每天灌胃PFOS 1次，從孕12 d到孕18 d持續(xù)染毒7 d，對(duì)照組給予含體積分?jǐn)?shù)為0.5% Tween 20的水溶液。孕19 d時(shí)戊巴比妥鈉麻醉后剖腹取胎，取出胎鼠和胎盤后，檢測胎鼠體質(zhì)量、體長和胎盤質(zhì)量。每窩取3～6只幼鼠，斷頭處死，盡快分離組織，液氮速凍，-80℃保存待用。

1.3.2 孕鼠血清PFOS和GC水平測定

將孕鼠血液3000 r/min，4℃離心30 min后收集上清。采用高效液相色譜/質(zhì)譜法測定血清PFOS含量，方法依照文獻(xiàn)[13]。按照血清糖皮質(zhì)激素ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀檢測記錄GC濃度水平。

1.3.3 胎鼠肝系數(shù)測量

取出胎鼠后，迅速將胎鼠肝用生理鹽水漂洗，用濾紙吸干肝水分后立即稱重。臟器系數(shù)計(jì)算方法：臟器系數(shù)=[胎鼠肝質(zhì)量(g)/胎鼠體質(zhì)量(g)] × 100%。

1.3.4 胎盤IGF-1的mRNA表達(dá)水平測定

每組隨機(jī)取4個(gè)胎盤30 mg組織加0.5 mL TRIzol液，用組織研磨杵充分研磨，根據(jù)試劑盒說明，提取SD鼠胎盤的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測IGF-1表達(dá)，以Rps16為內(nèi)參計(jì)算IGF-1表達(dá)量。反應(yīng)條件95℃預(yù)變性5 min，此后每循環(huán)變性95℃、30 s，退火60℃、30 s，延伸72℃、30 s，45個(gè)循環(huán)數(shù)。引物序列為：正向：5’-ACTCTGCTTGCTCACCTTTACC-3’；反向：5’-TCATCCACAATGCCCGTC-3’。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同劑量PFOS處理對(duì)孕鼠和胎鼠基本生長情況的影響

實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)孕鼠和胎鼠有死亡畸形，實(shí)驗(yàn)顯示，染毒后孕鼠的體質(zhì)量出現(xiàn)了明顯的下降，隨著PFOS劑量的加大體質(zhì)量降低趨勢(shì)愈加明顯，高劑量PFOS染毒組(20 mg/kg)孕鼠體質(zhì)量為(208.78 ± 19.45) g，與對(duì)照組(0 mg/kg)相比差異有顯著性(P< 0.001)。胎鼠的體質(zhì)量、體長和胎盤的質(zhì)量表現(xiàn)出相同的降低趨勢(shì)，高劑量PFOS染毒組(20 mg/kg)下降最為嚴(yán)重(P< 0.001)，見表1。

2.2 PFOS染毒對(duì)孕鼠血清PFOS及GC含量的影響

結(jié)果顯示，持續(xù)灌胃7 d后低、中、高實(shí)驗(yàn)組孕鼠血清中PFOS含量逐漸增加，與低劑量組相比，中、高劑量組PFOS累積更加嚴(yán)重(P< 0.001)。于此同時(shí)，孕鼠血清GC在高劑量組(20 mg/kg)表達(dá)顯著增加(表2，P< 0.05)。

2.3 PFOS染毒對(duì)胎鼠肝系數(shù)及胎盤IGF-1表達(dá)的影響

不同劑量PFOS染毒后，胎鼠的肝系數(shù)隨著PFOS劑量增加顯著降低。與對(duì)照組相比，中劑量PFOS染毒組(10 mg/kg)和高劑量PFOS染毒組(20 mg/kg)差異均有顯著性(分別為P< 0.05和P< 0.001)。IGF-1表達(dá)水平在低、中、高劑量PFOS染毒組胎盤中逐漸降低，差異有顯著性(表3)。

2.4 PFOS染毒對(duì)胎鼠肝生化的影響

不同劑量PFOS染毒后，胎鼠血液生化丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)與天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)也隨著PFOS給藥劑量的增加而增高。與對(duì)照組相比，低、中、高PFOS染毒組(20 mg/kg)差異均有顯著性(均為P< 0.05)(表4)。

表1 PFOS染毒后孕鼠和胎鼠體質(zhì)量和生長狀況Table 1 Body mass and growth of pregnant and fetal rats after PFOS exposure

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

表2 PFOS染毒后孕鼠血清PFOS及GC的平均濃度Table 2 Average concentrations of PFOS and GC in serum of pregnant rats after PFOS exposure

注：#低于檢測限。與低劑量組(5 mg/kg)比較，ΔΔΔP< 0.001；與對(duì)照組比較，*P< 0.05。
Note.#Lower than the detection limit. Compared with the low-dose group (5 mg/kg),ΔΔΔP< 0.001. Compared with the control group,*P< 0.05.

表3 PFOS染毒對(duì)胎鼠臟器系數(shù)及胎盤IGF-1表達(dá)的影響Table 3 Effects of PFOS exposure on organ coefficient and placental IGF-1 expression in fetal rats

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

表4 PFOS染毒對(duì)胎鼠血液生化的影響Table 4 Effects of PFOS on the blood biochemistry of fetal rats

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05。
Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

3 討論

PFOS作為一種常見的有機(jī)污染物，能夠通過胎盤屏障，對(duì)子代產(chǎn)生持續(xù)的發(fā)育毒性[14-15]。隨著PFOS愈加廣泛的應(yīng)用，國內(nèi)外對(duì)其在生殖、發(fā)育、神經(jīng)等種生命過程中直接或間接毒性作用研究愈加深入，特別是孕期PFOS暴露導(dǎo)致子代高死亡率已經(jīng)早有報(bào)道[16]。

母鼠與仔鼠的不同毒性效應(yīng)顯示成年和新生兒對(duì)PFOS的敏感度不同，暴露同樣劑量的PFOS可能對(duì)胚胎和新生兒的毒害作用更大。類似的胚胎期暴露和兩代繁殖實(shí)驗(yàn)表明PFOS能夠造成大小鼠的仔鼠死亡率升高和發(fā)育延遲[17-18]，本研究也發(fā)現(xiàn)PFOS的胚胎期暴露會(huì)導(dǎo)致仔鼠的發(fā)育延遲。

本研究發(fā)現(xiàn)孕鼠血清PFOS蓄積嚴(yán)重且隨著PFOS劑量濃度升高而顯著增加。同時(shí)胎鼠的體質(zhì)量、體長、胎盤質(zhì)量、胎鼠肝系數(shù)隨著PFOS劑量濃度升高而顯著降低，說明孕期大鼠PFOS暴露可以導(dǎo)致孕鼠血清PFOS蓄積從而使未出生的胎鼠肝功能受損，最終降低胎鼠的體質(zhì)量、體長、胎盤質(zhì)量。肝作為PFOS毒性作用的主要靶器官，一旦受損，外源化合物代謝將受到嚴(yán)重影響。PFOS能夠?qū)е聡?yán)重的肝損傷，因此PFOS對(duì)孕鼠和胎鼠的毒性作用可以從肝系數(shù)變化上得到一定程度的體現(xiàn)[19-20]。

本研究顯示，隨著PFOS劑量濃度的升高，孕鼠血清中的GC與PFOS表現(xiàn)出同樣的變化趨勢(shì)，與PFOS染毒濃度正相關(guān)，而胎盤中IGF-1表達(dá)水平卻表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)，隨PFOS染毒劑量的升高IGF-1表達(dá)逐漸降低。GC對(duì)胎兒的生長發(fā)育起著重要作用，既能借助促進(jìn)細(xì)胞的快速分化來幫助胎兒健全器官的發(fā)育和成熟；相反又可以介乎抑制細(xì)胞的增殖速度來調(diào)控胎兒不同組織的發(fā)育[12]。胰島素樣生長因子(IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)上類似于胰島素且功能接近的多肽，功能上在體內(nèi)參與幫助胚胎以及胎兒的個(gè)體發(fā)育，代謝上IGF-1可以影響脂肪、蛋白質(zhì)以及糖的代謝[21]。有報(bào)道顯示，在胎兒發(fā)育過程中胎兒、胎盤的生長發(fā)育會(huì)受到IGF-1的調(diào)控，與此同時(shí)IGF-1的表達(dá)會(huì)受到母源高GC水平的抑制[22]。

本研究通過孕期不同劑量PFOS染毒處理，證實(shí)其對(duì)孕鼠和胎鼠的生長有顯著的影響，對(duì)胎鼠的肝功能造成損傷。進(jìn)一步對(duì)孕鼠血清PFOS含量、GC含量和胎盤IGF-1表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，其變化趨勢(shì)與PFOS染毒劑量濃度密切相關(guān)。PFOS毒性機(jī)制可能是由于PFOS暴露并在孕鼠體內(nèi)蓄積導(dǎo)致母源性GC水平升高，降低了胎盤的IGF-1表達(dá)，從而使胎鼠肝受損，影響胎鼠的正常發(fā)育。