吳曉東，楊 錦，賈小娥,3，巴德仁貴,3，謝 偉,3 *，邵 國,3 *

(1. 包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心與神經(jīng)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)低氧轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 包頭 014040；3. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院低氧適應(yīng)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053)

低氧/缺血是目前臨床治療中常見的病癥及致病因素[1]，也是潛水、高原、航天等極端環(huán)境中面臨的重要課題。機(jī)體缺氧能夠引起神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，研究表明急性缺氧常導(dǎo)致腦損傷，并誘導(dǎo)神經(jīng)元的損傷因子產(chǎn)生[2-3]。而低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxic preconditioning，HPC)是機(jī)體受到多次短暫、非致死性的低氧刺激后產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[4]，能對(duì)機(jī)體組織尤其是腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用。HPC可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、遷移、細(xì)胞凋亡過程密切相關(guān)的因子表達(dá)，發(fā)揮其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的內(nèi)源性保護(hù)作用[5]，然而相關(guān)的分子機(jī)制仍未明確。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)是腦內(nèi)合成的一種堿性蛋白[6]，具有減少神經(jīng)元損傷和死亡、調(diào)控受損神經(jīng)元分化和再生以及監(jiān)視神經(jīng)元病理狀態(tài)等功能。酪氨酸激酶受體B(tyrosine kinase receptor B, TrkB)是BDNF特異性的受體[7]，二者結(jié)合后，可激活BDNF/TrkB信號(hào)通路途徑，對(duì)大腦正常發(fā)育、突觸可塑性以及神經(jīng)元板層結(jié)構(gòu)的形成發(fā)揮重要的生物學(xué)作用。研究發(fā)現(xiàn)[8]，急性低氧損傷可造成BDNF、TrkB受體及其信號(hào)通路的改變，但BDNF、TrkB受體及BDNF/TrkB信號(hào)通路是否參與HPC的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制則仍未有定論。因此，本文通過研究急性低氧和HPC對(duì)BDNF及其受體TrkB3在早、晚期相表達(dá)的影響以及對(duì)BDNF/TrkB信號(hào)通路活性產(chǎn)生的作用，為后續(xù)低氧研究特別是為HPC神經(jīng)保護(hù)的分子機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周后的SPF級(jí)雄性ICR小鼠(18～22 g)229只，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK (京) 2016-0002]。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(包院字20180901)，實(shí)驗(yàn)小鼠在自然通風(fēng)飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)[SYXK (京) 2015-0023]，實(shí)驗(yàn)在PCR室和蛋白操作室中進(jìn)行，建模在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室中進(jìn)行，取材操作在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備室中進(jìn)行。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予了人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

組織細(xì)胞裂解液，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；檢測蛋白濃度試劑盒，美國Thermo公司產(chǎn)品；蛋白酶抑制劑，美國Thermo公司產(chǎn)品；磷酸酶抑制劑，MCE公司產(chǎn)品；30%丙烯酰胺；Tris.Hcl液體及10%過硫酸銨；奶粉；胎牛血清；兔源單克隆抗體及HRP標(biāo)記羊抗兔抗體，美國SANTA公司產(chǎn)品；超敏發(fā)光液(北京普利賴基因公司)；TaKaRa公司產(chǎn)品；氯仿；異丙醇；75%酒精；DEPC水；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo公司產(chǎn)品；DNA合成引物，生物工程(上海)有限公司；Real-time PCR Mixture，北京康為生物技術(shù)有限公司。

超聲波破碎儀(FB 50)；酶標(biāo)儀(Multiskan FC)；制膠設(shè)備；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜設(shè)備(Trans-Blot)； 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon 5800)；掌上離心機(jī)(D1008)；臺(tái)式低速離心機(jī)(TDZ4-WS)； 小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5424R)； 混勻儀(MX-S/RL-Pro)； 恒溫振蕩器(SHZ-82)；微波爐(Galani)；Real-time PCR儀(ABI7900HT)；精密交流凈化穩(wěn)壓電源(PRECISE AC PURIFYING，REGUCATEO Power Supply)；磁力加熱攪拌機(jī)(MS-H280-Pro)；渦旋振蕩器(Thermo Fisher)天平(SQP型-QUINTIX313)等。250 mL的透明廣口瓶、塞橡塞、秒表、鑷子、手術(shù)刀、離心管等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重復(fù)低氧小鼠模型的建立

將實(shí)驗(yàn)小鼠放入250 mL的透明廣口瓶中，塞緊橡膠塞，立刻計(jì)時(shí)并觀察小鼠的呼吸狀態(tài)。當(dāng)小鼠達(dá)到低氧非致死狀態(tài)時(shí)，即小鼠出現(xiàn)仰式呼吸，大口喘氣，出現(xiàn)痙攣。迅速拔下橡膠塞，快速取出小鼠，記錄時(shí)間，該小鼠為低氧1次，低氧1次組的小鼠模型構(gòu)建成功，實(shí)驗(yàn)結(jié)束。若是低氧4次組的小鼠則繼續(xù)重復(fù)上述步驟，取出小鼠后，記錄時(shí)間，待小鼠由仰式呼吸轉(zhuǎn)為背式時(shí)，再次迅速放入廣口瓶中進(jìn)行重復(fù)低氧，共4次。本實(shí)驗(yàn)將低氧1次和低氧4次后即刻處死的小鼠記為0天低氧組(H1-0，H4-0)；低氧后1天處死的小鼠記為1天低氧組(H1-1，H4-1)；低氧后2天處死的小鼠記為2天低氧組(H1-2，H4-2)；低氧后3天處死的小鼠記為3天低氧組(H1-3，H4-3)；低氧后4天處死的小鼠記為4天低氧組(H1-4，H4-4)；未低氧直接處死的小鼠記為對(duì)照組(H0-0)。小鼠處死后，立即剝離小鼠左右海馬，放入1.5 mL的EP管中并標(biāo)記，然后凍存在-80℃的冰箱中。

1.3.2 Real-time PCR

使用Trizol法提取總RNA，在裝有小鼠海馬組織的EP管內(nèi)加入300 μL TRIzol液，用勻漿儀研磨20下，形成粉紅色的勻漿。再加入200 μL液并用注射器上下吸打10次,將勻漿樣品放置在冰上5 min，放入離心機(jī)離心(12000 r/min，4℃，5 min)。取上清加入100 μL氯仿(氯仿：TRIzol=0.2∶1)，溫和上下混勻20次，室溫放置15 min，再離心(13000 r/min，4℃，5 min)。取上清于新EP管中并標(biāo)記，加入250 μL預(yù)冷異丙醇(異丙醇∶TRIzol=0.5∶1)，上下混勻20次并離心(13000 r/min，4℃，10 min)，離心后棄除上清即出現(xiàn)貼壁的RNA。加入1 mL75%預(yù)冷酒精洗滌RNA沉淀用手指彈EP管，使RNA漂起。1000 r/min，4℃，5 min離心，棄上清，室溫干燥RNA沉淀。最后加入25 μL無酶水回融，測OD值。 使用First Strand Cdna Synthesis試劑盒(Thermo公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。引物由生物工程(上海)有限公司合成，BDNF 基因、TrkB基因和β-Actin基因引物的設(shè)計(jì)見表 1。在96孔板(ABI公司)加入3 μLcDNA Template，1 μL primer，10 μL Mix以及高壓水6 μL共20 μL，每個(gè)待測樣品需重復(fù)3個(gè)空，3000 r/min，10 min離心。放入ABI7900HT Real-time PCR儀中，反應(yīng)條件為50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，72℃ 2 min延伸。

1.3.3 Western blot 電泳

總磷酸化的TrkB(分子量為140× 103)需配配制6%的分離膠；位點(diǎn)磷酸化的TrkB及TrkB(分子量分別為90× 103, 95× 103)需配8%的分離膠；BDNF(分子量為14× 103)需配12%的分離膠，5%的濃縮膠。TrkB蛋白加樣量為20 μg，BDNF蛋白的加樣量為30 μg。電泳濃縮膠恒流49 mA；分離膠恒流39 mA。轉(zhuǎn)膜，恒流400 mA，BDNF1小時(shí)，TrkB蛋白2-3 h。封閉，除了位點(diǎn)磷酸化的TrkB需用0.5%胎牛血清封閉外，其他蛋白均用5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST洗膜10/次，3次。孵育一抗，一抗 在4℃搖床上孵育過夜。 二抗孵育，二抗室溫300 rmp搖床上孵育2 h。顯影，用等體積的超敏發(fā)光液A液和B液浸泡膜，曝片(自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)Tanon 5800)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為方差分析(ANOVA)和t檢驗(yàn)，比較了相同低氧次數(shù)不同天數(shù)處死組及相同天數(shù)處死不同低氧次數(shù)組之間的差異，P<0.05或P<0.01為差異有顯著性。

表1 基因引物序列Table 1 Gene primer sequences

2 結(jié)果

2.1 重復(fù)低氧后可以提高小鼠低氧耐受時(shí)間

小鼠經(jīng)低氧處理后，其低氧耐受時(shí)間隨著低氧次數(shù)的增加而增加，圖1顯示，后一次耐受時(shí)間比前一次耐受時(shí)間更明顯(P<0.05)。說明低氧模型和HPC模型構(gòu)建成功。

注：H0-0：未低氧直接處死的小鼠(對(duì)照組)；H1-0、H4-0：分別為低氧1次和低氧4次后即刻處死的小鼠(0天低氧組)；H1-1、H4-1：分別為低氧1次和低氧4次后1天處死的小鼠(1天低氧組)；H1-2、H4-2：分別為低氧1次和低氧4次后2天處死的小鼠(2天低氧組)；H1-3、H4-3：分別為低氧1次和低氧4次后3天處死的小鼠(3天低氧組)；H1-4、H4-4：分別為低氧1次和低氧4次后4天處死的小鼠(4天低氧組)。下圖同。與對(duì)照組相比，*P < 0.05。圖2 BDNF的Real time PCR和Western blot檢測結(jié)果Note. H0-0: mice not directly killed by hypoxia (control group); H1-0, H4-0: mice killed immediately after hypoxia once or hypoxia four times (0-day hypoxia group); H1-1, H4-1: mice killed one day after hypoxia once or hypoxia four times, respectively (1-day hypoxia group); H1-2, H4-2: mice killed two days after hypoxia once or hypoxia four times, respectively. Mice (2-day hypoxia group); H1-3, H4-3: mice were killed 3 days after hypoxia once or hypoxia four times, respectively (3-day hypoxia group); H1-4, H4-4: mice were killed 4 days after hypoxia once or hypoxia four times, respectively (4-day hypoxia group). The same in the following figures. Compared with the control group,*P < 0.05.Figure 2 The results of BDNF real-time PCR and Western blot

注：與前一次低氧組相比，*P < 0.05。圖1 小鼠不同低氧次數(shù)的耐受時(shí)間記錄Note. Compared with the previous hypoxia group,*P < 0.05.Figure 1 Tolerance timepoints of hypoxia in mice

2.2 低氧預(yù)適應(yīng)在早期相上調(diào)小鼠海馬中BDNF的表達(dá)

與對(duì)照組相比，急性低氧組和HPC組小鼠海馬中BDNF 在mRNA水平的表達(dá)都有增加的趨勢(圖2A)。而BDNF在HPC早期相(即低氧預(yù)適應(yīng)處理后1天)，相較于對(duì)照組其蛋白水平表達(dá)顯著升高(P<0.05)(圖2B)；但在晚期相，BDNF蛋白表達(dá)上調(diào)的并不明顯。因此，BDNF可能在HPC的早期通過表達(dá)上調(diào)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

2.3 低氧預(yù)適應(yīng)小鼠海馬中全長型TrkB的表達(dá)有上調(diào)的趨勢

與對(duì)照組相比，急性低氧早期相小鼠海馬中的全長型 TrkB mRNA和蛋白表達(dá)均有降低的趨勢，而中期相mRNA表達(dá)變化不明顯(圖3A)，晚期相蛋白表達(dá)變化不明顯(圖3B)。相較于對(duì)照組，HPC早期相小鼠海馬中的全長型 TrkB mRNA和蛋白表達(dá)均有增加的趨勢；但在晚期相mRNA表達(dá)變化不明顯(圖3A)，中期相蛋白表達(dá)變化不明顯(圖3B)。因此，全長型 TrkB可能在低氧預(yù)適應(yīng)的早期相表達(dá)增加，并可能改變BDNF/TrkB信號(hào)通路的活性。

2.4 低氧預(yù)適應(yīng)在中晚期相下調(diào)小鼠海馬中截短型TrkB的表達(dá)

與對(duì)照組相比，低氧組截短型TrkB受體表達(dá)則有降低的趨勢，在HPC中、晚期相(即低氧預(yù)適應(yīng)處理后2、4天)其mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)(圖4A)，但截短型TrkB 蛋白表達(dá)有降低的趨勢但差異無顯著性(圖4B)。因此，截短型 TrkB可能在HPC的中晚期相表達(dá)下調(diào)，也有可能影響B(tài)DNF/TrkB信號(hào)通路的活性。

2.5 低氧抑制小鼠海馬中BDNF/TrkB信號(hào)通路的活性，而低氧預(yù)適應(yīng)晚期相可激活信號(hào)通路

在HPC中BDNF與TrkB受體表達(dá)均發(fā)生變化，很有可能其信號(hào)通路活性也會(huì)隨之變化，因此我們又檢測了低氧和HPC情況下BDNF/TrkB信號(hào)通路的活性。與對(duì)照組相比，急性低氧組BDNF/TrkB信號(hào)通路活性明顯的被抑制(P<0.05、P<0.01)，而HPC組BDNF/TrkB信號(hào)通路活性有增加的趨勢，且在晚期相(即低氧預(yù)適應(yīng)處理后4天)(P<0.05)(圖5)。因此，HPC在晚期相可能通過激活BDNF/TrkB信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)HPC是機(jī)體在非致死性缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。HPC可能是通過上調(diào)保護(hù)性因子表達(dá)，或下調(diào)損傷性因子表達(dá)，從而達(dá)到內(nèi)源性保護(hù)作用。如在神經(jīng)系統(tǒng)，HPC可通過下調(diào)NR2B、HESC等因子產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)[8-9]，HPC通過高表達(dá)Bcl-2、Caspase-3、PKC、CaveOLI-3等因子產(chǎn)生保護(hù)作用[5-10]。但是分子機(jī)制仍未明確。而我們通過構(gòu)建低氧和HPC小鼠模型，也是為了探索其中發(fā)揮作用的保護(hù)性因子及相關(guān)機(jī)制，以上實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了小鼠低氧耐受時(shí)間隨著低氧次數(shù)的增加有上升的趨勢(P<0.05)，表明模型構(gòu)建成功，一些因子表達(dá)可能發(fā)生變化，從而增加小鼠低氧耐受時(shí)間。

圖3 全長型TrkB的Real time PCR和 Western blot結(jié)果Figure 3 The results of full-length TrkB real-time PCR and Western blot

注：與對(duì)照組相比，*P < 0.05。圖4 截短型TrkB的Real time PCR和 Western blot檢測結(jié)果Note. Compared with the control group,*P < 0.05.Figure 4 The results of truncated TrkB real-time PCR and Western blot

注：與對(duì)照組相比，*P < 0.05，** P < 0.01。圖5 磷酸化的 TrkB蛋白的Western blot結(jié)果Note. Compared with the control group,*P < 0.05,** P < 0.01.Figure 5 The Western blot results of phospho-TrkB protein

BDNF廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的分化和突觸可塑性，尤其是對(duì)小腦海馬結(jié)構(gòu)的發(fā)育起到中要的作用[11]。Sciesielski等發(fā)現(xiàn)小鼠HPC時(shí)可以刺激神經(jīng)細(xì)胞中的BDNF表達(dá)上調(diào)[12]。最新研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)BDNF表達(dá)受缺氧環(huán)境的影響，并且它參與了神經(jīng)保護(hù)和修復(fù)的機(jī)制[13]。我們研究也發(fā)現(xiàn)急性低氧組和低氧預(yù)適應(yīng)組小鼠海馬中的BDNF表達(dá)都有增加的趨勢，并且HPC組的BDNF蛋白表達(dá)在早期相增高顯著(P<0.05)。因此BDNF可能通過在早期相的高表達(dá)參與了HPC的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

TrkB是BDNF的特異性受體，其主要分為兩大亞型，即全長型的Trk B受體(140×103)和截短型TrkB受體(90×103)，前者與BDNF結(jié)合可正常激活BDNF/TrkB信號(hào)通路，后者可通過異二聚體抑制BDNF/TrkB信號(hào)通路活性[14]。BDNF/TrkB信號(hào)通路激活后可以改善神經(jīng)功能、減少梗死體積以及修復(fù)受損神經(jīng)元[15]。Tian等在海馬神經(jīng)元缺氧研究中提出急性低氧時(shí)海馬中TrkB的表達(dá)量出現(xiàn)降低的趨勢[16]。而小鼠經(jīng)多次低氧后，TrkB受體促使與其配體BDNF結(jié)合，對(duì)后期神經(jīng)元的損傷進(jìn)行修復(fù)并增加存活率[17]。我們研究發(fā)現(xiàn)HPC后全長型 TrkB表達(dá)有增加的趨勢，而截?cái)嘈蚑rkB的mRNA表達(dá)在晚期相顯著降低，由于mRNA表達(dá)變化發(fā)生在HPC晚期，所以截短型TrkB在蛋白水平表達(dá)的顯著變化我們未能觀察到，可能在HPC的更晚時(shí)間其表達(dá)才會(huì)發(fā)生顯著差異。這有待于我們繼續(xù)通過實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。由此可見，HPC一方面可能上調(diào)全長型的TrkB受體表達(dá)，另一方面下調(diào)截短型TrkB受體表達(dá)，都可能影響B(tài)DNF/TrkB信號(hào)通路的活性。

既然小鼠HPC可導(dǎo)致BDNF和TrkB受體表達(dá)變化，而BDNF和TrkB受體結(jié)合后激活信號(hào)通路，因此HPC的保護(hù)作用可能是通過BDNF/TrkB信號(hào)通路活性變化而實(shí)現(xiàn)的。因此我們進(jìn)一步研究了BDNF/TrkB信號(hào)通路活性在HPC狀態(tài)下的變化情況。前人研究發(fā)現(xiàn)低氧抑制BDNF/TrkB信號(hào)通路，當(dāng)加入δ-阿片受體激活劑，該信號(hào)通路從新被激活，進(jìn)而細(xì)胞的凋亡和線粒體膜電位抑制得到了改善[9-16]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比。急性低氧組BDNF/TrkB信號(hào)通路被抑制，與急性低氧組相比，HPC后磷酸化的TrkB表達(dá)有升高的趨勢，尤其在晚期相(低氧預(yù)適應(yīng)4天后)顯著增加(P<0.05)。由此我們猜測HPC是通過增加BDNF表達(dá)，促使BDNF與其受體結(jié)合，從而使TrkB酪氨酸殘基磷酸化，信號(hào)通路被激活，以及HPC使截短型TrkB表達(dá)下調(diào)，異二聚體減少，進(jìn)而減少了對(duì)信號(hào)通路的抑制，在這兩種機(jī)制的共同作用下，激活BDNF/TrkB信號(hào)通路，通過調(diào)控神經(jīng)元損傷和修復(fù)、增加神經(jīng)元突觸性以及監(jiān)視神經(jīng)元病理狀態(tài)等方面對(duì)大腦產(chǎn)生了保護(hù)作用。