蘭翀，聶小毳，史玉林，徐洪濤

（1. 沈陽市婦嬰醫(yī)院婦科，沈陽 110011； 2. 中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學教研室，沈陽 110122）

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生殖健康。近年的研究表明，宮頸癌發(fā)病率呈年輕化趨勢。全世界范圍內(nèi)，每年約有50萬宮頸癌新發(fā)病例。子宮頸上皮內(nèi)病變是一組與宮頸癌密切相關的癌前病變的總稱，反映了宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的連續(xù)過程。甲狀腺癌相關因子1 （thyroid cancer-1，TC1） 是近年發(fā)現(xiàn)的由C8orf4基因編碼的一種核蛋白，首先在甲狀腺乳頭狀癌中發(fā)現(xiàn)其表達［1］。作為Wnt信號通路上游調(diào)節(jié)基因，TC1可以與β-連環(huán)蛋白（β-catenin） 競爭性結合Chibby，間接增強 Wnt信號通路介導的轉(zhuǎn)錄作用，從而增強腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力［2］。另外，TC1 還能被有絲分裂素調(diào)節(jié)，促進細胞從G1向S期轉(zhuǎn)化，加速細胞周期，促進細胞增殖［3］。研究［4-8］表明，TC1在乳腺癌、胃癌、口腔鱗癌、肺癌、卵巢癌等惡性腫瘤中均表達增高，并與腫瘤的惡性表型和進展相關。β-catenin作為一種細胞黏附分子，是Wnt信號通路的核心，能介導細胞黏附和參與Wnt途徑的信號傳導功能，與結直腸癌［9］、胃癌［10］、肺癌［11］、宮頸癌［12］、惡性黑色素瘤［13］等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移有密切關系。目前，TC1在宮頸癌及癌前病變中的表達情況在國內(nèi)外均未見報道。本研究采用免疫組化方法檢測正常宮頸組織、子宮頸上皮內(nèi)病變和宮頸鱗癌組織中TC1和β-catenin的表達情況，探討二者在宮頸鱗癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用，并分析它們之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例與標本：收集沈陽市婦嬰醫(yī)院2012年1月至2017年12月病理科存檔的宮頸石蠟組織標本共190例。正常宮頸組織30例，患者平均年齡（36.50±9.83） 歲 （19～63歲） 。宮頸上皮內(nèi)病變組織80例，患者平均年齡 （38.15±10.22） 歲 （23～70歲）；其中高級別鱗狀上皮內(nèi)病變 （high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL） 與低級別鱗狀上皮內(nèi)病變 （low-grade squamous intraepithelial lesion，LSIL） 各40例。宮頸鱗癌組織80例，患者平均年齡為（39.29±11.12） 歲 （20～62歲）；其中高分化52例，中分化20例，低分化8例；按FIGO 2009年臨床分期標準，ⅠA期16例，ⅠB期52例，ⅡA期12例。所有患者術前均未接受放化療等治療。所有標本均常規(guī)行10%甲醛稀釋液 （100 mL/L） 固定和石蠟制片，切片經(jīng)2名以上病理醫(yī)師確診。

1.1.2 試劑：兔抗人TC1多克隆抗體 （ab133885） 購自美國Abcam公司，鼠抗人β-catenin單克隆抗體（610154） 購自美國BD生物技術公司，S-P超敏免疫組化試劑盒 （KIT-9710） 和DAB 酶底物顯色試劑盒（DAB-0031） 均購自福州邁新生物技術公司。

1.2 方法

將石蠟包埋組織標本制成4 μ m切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫苯、水化后，進行免疫組化染色，按試劑說明書操作，TC1和β-catenin一抗?jié)舛染鶠?∶200，以PBS取代一抗作為陰性對照?？乖迯鸵簽閜H6.0檸檬酸緩沖液。經(jīng)DAB染色后，蘇木素對比染色，中性樹膠封片。

結果判定：在400倍鏡下選鱗狀上皮細胞或癌細胞陽性染色集中區(qū)域，每例標本選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個鱗狀上皮細胞或癌細胞，計算陽性細胞占計數(shù)細胞總數(shù)的百分比。TC1的陽性表達定位于細胞質(zhì)。β-catenin在正常鱗狀上皮中為細胞膜表達，當出現(xiàn)細胞質(zhì)或細胞核表達時為異常表達。TC1和β-catenin均以細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色顆粒為陽性表達。計數(shù)陽性細胞數(shù)＜25%為低表達；25%～＜75%為中等表達；≥75%為高表達。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用χ2檢驗和似然比法分析β-catenin、TC1的表達與子宮頸癌及癌前病變臨床病理因素的關系，采用Spearman等級相關分析TC1與β-catenin表達的關系。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TC1在宮頸鱗癌、上皮內(nèi)病變和正常宮頸組織中的表達

TC1表達定位于細胞質(zhì)。TC1高表達率和中等表達率在宮頸鱗癌中分別為38.8% （31/80） 和31.2%（25/80）；在宮頸HSIL組織中分別為32.5% （13/40）和35.0% （14/40）；在宮頸LSIL組織中分別為15.0%（6/40） 和30.0% （12/40）；在正常宮頸組織中分別為6.7% （2/30） 和26.7% （8/30） 。見圖1。

TC1在宮頸鱗癌中的表達率顯著高于LSIL （P=0.002） 和正常宮頸組織 （P＜ 0.001） ，而與HSIL組織相比無統(tǒng)計學差異 （P= 0.576）；TC1在HSIL組織中的表達顯著高于LSIL （P＜ 0.001） 和正常宮頸組織（P＜ 0.001）；正常宮頸組織與LSIL組織中TC1的表達無統(tǒng)計學差異 （P= 0.458） 。見表1。TC1的表達與宮頸鱗癌的低分化程度 （P= 0.005） 和高分期 （P=0.004） 相關，而與患者年齡無關 （P= 0.760） 。見表2。

2.2 β-catenin 在宮頸鱗癌、上皮內(nèi)病變和正常宮頸組織中的表達

圖1 TC1在宮頸病變和正常宮頸鱗狀上皮中的表達 免疫組化S-P法×400Fig.1 Expression of TC1 in cervical lesions and normal cervical squamous epithelium S-P immunohistochemistry×400

表1 TC1和β-catenin在宮頸病變和正常宮頸組織中的表達Tab.1 TC1 and β-catenin expression in cervical lesions and normal cervical tissues

在正常宮頸組織和LSIL組織中，均可見β-catenin的細胞膜表達，少數(shù)病例可同時伴有細胞質(zhì)表達。正常宮頸組織和LSIL組織中β-catenin的陽性表達率無統(tǒng)計學差異 （P= 0.295） 。β-catenin的細胞質(zhì)異常高表達率和中等表達率在LSIL組織中分別為17.5% （7/40） 和40.0% （16/40）；在HSIL組織中分別為52.5% （21/40） 和30.0% （12/40）；在宮頸鱗癌中分別為52.50% （42/80） 和32.5% （26/80） 。 見圖2。

β-catenin在宮頸鱗癌中的異常表達率顯著高于LSIL組織 （P＜ 0.001） 和正常宮頸組織 （P＜ 0.001） ，而與HSIL組織相比無統(tǒng)計學差異 （P= 0.907） 。β-catenin在HSIL組織中的異常表達率顯著高于LSIL組織 （P= 0.003） 和正常宮頸組織 （P＜ 0.001） 。見表1。β-catenin的表達與宮頸鱗癌的低分化程度 （P=0.025） 和高分期 （P= 0.001） 相關，而與患者的年齡無關 （P= 0.778） 。見表2。

2.3 TC1在宮頸病變中的表達與β-catenin的異常表達相關

圖2 β-catenin在宮頸病變和正常宮頸鱗狀上皮中的表達 免疫組化S-P法×400Fig.2 Expression of β-catenin in cervical lesions and normal cervical squamous epithelium S-P immunohistochemistry×400

表2 TC1和β-catenin表達與宮頸鱗癌臨床病理因素的關系Tab.2 Relationship between TC1 and β-catenin expression and clinicopathological factors in cervical squamous cell carcinoma

Spearman相關分析發(fā)現(xiàn)，TC1在宮頸鱗癌中的表達與β-catenin的異常表達呈顯著正相關 （r=0.294，P= 0.008） 。同樣，TC1在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變中的表達也與β-catenin的異常表達呈顯著正相關 （r=0.549，P＜ 0.001） 。見表3。

表3 TC1與β-catenin在宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變和宮頸鱗癌組織中表達的相關性Tab.3 Correlation between TC1 and β-catenin expression in cervical squamous intraepithelial lesions and cervical squamous cell carcinoma

3 討論

子宮頸癌是女性生殖道三大惡性腫瘤之一。目前認為，高危型人類乳頭狀瘤病毒 （human papillomavirus，HPV） 持續(xù)性感染是宮頸病變發(fā)生的元兇，99%以上的宮頸癌與高危型HPV持續(xù)感染有關。應該說，宮頸癌的發(fā)生是一個緩慢的過程，從高危型HPV感染正常宮頸組織到宮頸上皮內(nèi)病變，再到宮頸癌一般需要數(shù)年的時間。雖然病因明確，但子宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機制目前尚不清楚，Wnt信號傳導通路的激活可能在宮頸癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮了重要作用［14］。在宮頸癌形成過程中，Wnt通道中上游信號激活與β-catenin異常聚集是腫瘤形成過程中的關鍵兩點。β-catenin一方面與鈣黏蛋白結合形成復合體，維持細胞黏附功能。另一方面作為Wnt信號關鍵蛋白，其在胞質(zhì)內(nèi)的濃度直接影響Wnt信號通路的開放或關閉。本研究發(fā)現(xiàn)，在正常宮頸組織及LSIL組織中，β-catenin普遍呈連續(xù)細胞膜表達，β-catenin的異常表達不明顯。LSIL組織中，其異常表達稍高于正常宮頸組織，但二者之間差異不明顯。相反，在HSIL和宮頸鱗癌組織中，β-catenin異常表達于細胞質(zhì)中，并顯著高于LSIL和正常宮頸組織。同時，β-catenin的異常表達還與宮頸鱗癌的低分化和高分期密切相關。通過以上結果，可以認為β-catenin的異常表達在宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展中，有不可忽視的促進作用。

TC1作為Wnt信號通路上游調(diào)節(jié)基因，與β-catenin競爭結合Chibby，減輕 Chibby對下游靶基因如cyclin D1、MMP-7、c-myc等的抑制作用，從而間接增強Wnt信號通路介導的轉(zhuǎn)錄作用，增強腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力［2］。LAN等［8］發(fā)現(xiàn)，TC1在卵巢癌中的高表達與卵巢癌的分型、分化和TNM分期相關，并與β-catenin的異常表達相關。而且TC1的高表達可能通過Wnt信號傳導通路促進卵巢癌的惡性進展。本研究發(fā)現(xiàn)，TC1在HSIL和宮頸鱗癌組織中的表達率明顯高于LSIL和正常宮頸組織，而且TC1的表達與宮頸鱗癌的低分化程度和高分期相關，提示TC1可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關。同時，本研究在宮頸鱗癌和宮頸上皮內(nèi)病變中均發(fā)現(xiàn)，β-catenin的異常表達與TC1的陽性表達顯著正相關，說明二者有協(xié)同促進宮頸病變進展的作用。TC1的高表達可能通過上調(diào)β-catenin的異常表達提高Wnt信號傳導通路活性，進而促進Wnt通路靶基因的表達和宮頸病變的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，TC1和β-catenin在宮頸鱗癌和HSIL組織中的表達顯著高于LSIL和正常宮頸組織；TC1在宮頸鱗癌中的表達與β-catenin的異常表達相關，并與宮頸鱗癌的低分化程度和高分期相關。TC1與β-catenin的異常表達與子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關，深入研究TC1和Wnt信號通路之間的表達調(diào)控可能為宮頸癌的診斷和靶向治療提供新的線索和思路。