吳桂輝 黃濤 羅槑 蔡陽 何畏 陳蕾

維生素D是一種脂溶性維生素，具有調(diào)節(jié)鈣磷代謝和調(diào)節(jié)免疫功能等多種重要作用。早在20世紀(jì)40年代，在結(jié)核分枝桿菌被發(fā)現(xiàn)之前，補(bǔ)充維生素D和(或)曬太陽曾被用于治療結(jié)核病[1]。隨后，越來越多的研究顯示多種疾病與維生素D缺乏有著密切的關(guān)系[2]。維生素D的活性代謝產(chǎn)物——25-羥基維生素D3[25-(OH)D3]具有抑制炎癥細(xì)胞因子反應(yīng)的作用，通過與維生素D受體(VDR)的結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的應(yīng)答能力和抑制炎癥因子等作用，從而抑制結(jié)核分枝桿菌的生長；同時25-(OH)D3與VDR結(jié)合后還能夠產(chǎn)生內(nèi)源性人抗菌肽LL-37，其可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞殺滅結(jié)核分枝桿菌的作用。本研究通過分析25-(OH)D3和LL-37在不同類型活動性肺結(jié)核患者及健康人群中表達(dá)水平的差異，探索活動性結(jié)核病患者新的診療途徑。

資料和方法

一、研究對象

選擇2017年6—12月成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心結(jié)核科住院的全部符合入選標(biāo)準(zhǔn)的178例活動性肺結(jié)核患者，以及本院同期進(jìn)行健康體檢的符合入選標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)務(wù)人員100名(按照計劃標(biāo)準(zhǔn)納入到100名為止)。

1. 入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18～60歲；漢族；居住在四川省。

2. 排除標(biāo)準(zhǔn)：有以下任意一項者即排除。(1)并發(fā)影響維生素D水平和鈣、磷代謝的疾病，如甲狀旁腺功能亢進(jìn)、腎功能衰竭、惡性腫瘤等；(2)在納入前30 d內(nèi)患者使用過糖皮質(zhì)激素；(3)目前正在使用細(xì)胞毒性類或免疫抑制劑藥物，或并發(fā)自身免疫系統(tǒng)疾病、HIV感染等；(4)處于妊娠和哺乳期者；(5)營養(yǎng)不良者；(6)3個月內(nèi)服用含維生素D的保健品及藥品者。

3. 診斷標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核的診斷符合《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》[3]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；肺外結(jié)核的診斷符合《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]；糖尿病的診斷符合《中國2型糖尿病防治指南(2010年版)》[5]制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。營養(yǎng)不良的診斷參照《營養(yǎng)風(fēng)險篩查NRS 2002》的標(biāo)準(zhǔn)，營養(yǎng)受損部分評分≥3分評定為營養(yǎng)不良。肺結(jié)核病情嚴(yán)重程度標(biāo)準(zhǔn)：病灶≥3個肺野或毀損肺，同時并發(fā)低氧血癥或呼吸衰竭，臨床可診斷為重癥肺結(jié)核；病灶≤2個肺野，不伴有血?dú)夥治霎惓檩p癥肺結(jié)核[6]。

4. 分組情況：符合入選及排除標(biāo)準(zhǔn)的健康對照者(A組)共計100名；肺結(jié)核患者共計178例，其中單純肺結(jié)核患者81例(B組)，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者57例(C組)，結(jié)核病(包括肺結(jié)核或肺外結(jié)核)并發(fā)糖尿病患者40例(D組)。肺結(jié)核患者以入院時病情嚴(yán)重程度為標(biāo)準(zhǔn)，重癥肺結(jié)核患者共79例，其中單純肺結(jié)核患者13例(16.45%)，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者39例(49.37%)，結(jié)核病并發(fā)糖尿病患者27例(34.18%)；輕癥肺結(jié)核患者99例，其中單純肺結(jié)核患者68例(68.69%)，肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核患者18例(18.18%)，結(jié)核病并發(fā)糖尿病患者13例(13.13%)。

5. 一般情況：四組人群在年齡、性別等方面的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均>0.05)，見表1。

6. 倫理審核：本研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理審查委員會審批通過(編號：2014Y-19)，所有人群均知情同意。

二、研究方法

1. 檢查方法及標(biāo)準(zhǔn)：研究對象均抽取外周靜脈血3 ml，分裝標(biāo)本于-80 ℃保存待檢。維生素D和LL-37水平均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進(jìn)行檢測。維生素D水平以血25-(OH)D3衡量，采用英國IDS公司25-(OH)D3檢測試劑盒測定，以30 nmol/L 和50 nmol/L作為機(jī)體維生素D缺乏和充足的分界點(diǎn)[7]。采用美國Hycult biotech公司HK321(Human LL-37)試劑盒進(jìn)行LL-37水平的測定。

表1 各組研究對象一般情況的比較

2. 檢查指標(biāo)：對比各組肺結(jié)核患者和健康對照者外周血25-(OH)D3、LL-37水平的差異；同時，對比病情嚴(yán)重程度不同的患者外周血25-(OH)D3、LL-37 水平的差異。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、各組人群外周血25-(OH)D3及LL-37水平的比較

4個組25-(OH)D3及LL-37水平的比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。見表2。兩兩比較顯示，B、C、D組外周血25-(OH)D3水平均明顯低于A組，LL-37水平均明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.61，P=0.000；t=6.48，P=0.000；t=5.72，P=0.000和t=2.26，P=0.025；t=4.48，P=0.000；t=4.03，P=0.000)；B組血清25-(OH)D3水平均明顯高于C組和D組，LL-37水平均明顯低于C和D組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.64，P=0.008；t=2.52，P=0.011和t=2.14，P=0.032；t=2.29，P=0.022)；C組和D組25-(OH)D3和LL-37水平的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.30，P=0.767；t=0.49，P=0.627)。

二、不同病情患者血清25-(OH)D3和LL-37水平的比較

重癥肺結(jié)核患者外周血25-(OH)D3水平明顯低于輕癥肺結(jié)核患者，LL-37水平明顯高于輕癥肺結(jié)核患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。見表3。

討 論

早在20世紀(jì)40年代，人們就發(fā)現(xiàn)通過日光照射或補(bǔ)充富含魚油的食物，可以治療結(jié)核病。經(jīng)過一系列的研究，發(fā)現(xiàn)維生素D能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)，具有抑制結(jié)核分枝桿菌生長的作用，闡明了維生素D缺乏與結(jié)核病易感性具有相關(guān)性[8]。

機(jī)體巨噬細(xì)胞是對抗結(jié)核分枝桿菌感染的主要力量。維生素D本身并無抗結(jié)核作用，而是其活性代謝產(chǎn)物25-(OH)D3通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對結(jié)核分枝桿菌的殺菌能力[9]，促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使巨噬細(xì)胞增多等，調(diào)節(jié)結(jié)核感染者的宿主免疫反應(yīng)，抑制結(jié)核分枝桿菌的生長[10-11]。人體T細(xì)胞主要分為輔助性T細(xì)胞(Th)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。Th細(xì)胞包括Th1和Th2，Th1和Th2是互為抑制性的T細(xì)胞。目前認(rèn)為，Th1和Th2免疫反應(yīng)平衡時才有利于對結(jié)核感染的控制，無論是Th1還是Th2增多，都不利于結(jié)核分枝桿菌感染的控制，并會增加機(jī)體組織免疫損傷[12]。Prabhu等[13]發(fā)現(xiàn)25-(OH)D3可以抑制Th1的免疫應(yīng)答，使γ干擾素(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)生成減少，從而減輕感染部位的炎癥反應(yīng)。故當(dāng)機(jī)體缺乏維生素D時，其代謝產(chǎn)物25-(OH)D3傳遞信號減弱，表現(xiàn)出Th1優(yōu)勢免疫應(yīng)答，引起過強(qiáng)免疫反應(yīng)造成組織損傷。因此，25-(OH)D3在維持機(jī)體免疫應(yīng)答平衡中發(fā)揮著重要作用，使機(jī)體在免疫損傷最小的情況下清除結(jié)核分枝桿菌。所以，體內(nèi)25-(OH)D3水平低可能會增加罹患結(jié)核病的風(fēng)險。Iftikhar等[8]報道，肺結(jié)核患者體內(nèi)25-(OH)D3水平低并發(fā)肺外結(jié)核的風(fēng)險更大，較高的血清25-(OH)D3水平對結(jié)核病和糖尿病均有保護(hù)作用[14]。本研究也提示肺結(jié)核并發(fā)肺外結(jié)核、結(jié)核病并發(fā)糖尿病患者體內(nèi)25-(OH)D3水平均較單純肺結(jié)核患者低。其原因除了與上述機(jī)體免疫狀態(tài)低下有關(guān)，還可能與VDR的基因多態(tài)性有關(guān)[15]。體內(nèi)25-(OH)D3與VDR結(jié)合形成的受體復(fù)合物可與靶基因特定DNA序列上的類固醇激素反應(yīng)元件結(jié)合，從而對結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。

表2 各組患者外周血25-(OH)D3和LL-37水平的比較

表3 不同病情肺結(jié)核患者外周血25-(OH)D3和LL-37水平的比較

結(jié)核分枝桿菌感染人群后，約有5%～10%的被感染者可發(fā)展為活動性結(jié)核病患者，其中1%～3%會發(fā)展為重癥結(jié)核病[16]。機(jī)體免疫功能受損是病情進(jìn)展的主要基礎(chǔ)，維生素D通過先天免疫及獲得性免疫機(jī)制影響機(jī)體免疫狀態(tài)及病情發(fā)展程度。Coussens等[17]研究指出，維生素D可以對多種細(xì)胞及細(xì)胞因子發(fā)揮作用，協(xié)助消除結(jié)核病的炎癥反應(yīng)，控制炎癥病理損傷，進(jìn)而影響肺結(jié)核的發(fā)生及嚴(yán)重程度，從而降低患者死亡風(fēng)險。我國韓駿鋒和吳琦[18]的研究也提示，維生素D水平與肺結(jié)核病變嚴(yán)重程度存在關(guān)聯(lián)，與本研究結(jié)果相似?？梢?，當(dāng)人體內(nèi)維生素D不足時，其對結(jié)核分枝桿菌的限制及人體內(nèi)各種細(xì)胞因子的功能將產(chǎn)生不利影響，從而影響肺結(jié)核的發(fā)生及嚴(yán)重程度。

由此推測，對于已經(jīng)罹患肺結(jié)核的維生素D缺乏患者，補(bǔ)充維生素D可能會促進(jìn)疾病的恢復(fù)。但是事實是否如此？在迄今為止樣本量最大的隨機(jī)對照研究中，幾內(nèi)亞365例肺結(jié)核患者被隨機(jī)分為兩組[19]，實驗組入組時及開始進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核藥物治療第5、8 個月時分別給予2.5 mg 維生素D3，對照組給予安慰劑，試驗結(jié)束后兩組首要結(jié)局指標(biāo)(結(jié)核病臨床嚴(yán)重程度評分)及次要結(jié)局指標(biāo)(12個月死亡率)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而Salahuddin等[20]對259例肺結(jié)核患者接受抗結(jié)核藥物治療的同時，隨機(jī)肌內(nèi)注射315 mg維生素D或生理鹽水(2次/月)，12 周后試驗組患者體質(zhì)量增加及影像學(xué)改變較對照組明顯。面對上述研究結(jié)果的差異性，可能與治療人群抗結(jié)核藥物治療方案的差異及維生素D目前尚無確切的最佳適宜補(bǔ)充劑量有關(guān)。

在維生素D引起機(jī)體免疫反應(yīng)并與結(jié)核分枝桿菌斗爭的過程中，LL-37扮演了相對重要的角色。LL-37主要是中性粒細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種人抗菌肽，具有廣泛的免疫活性，發(fā)揮既促炎又抗炎的效應(yīng)。LL-37是以依賴維生素D的方式在體內(nèi)由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞合成的，其可以抑制白細(xì)胞介素12p40(IL-12p40)的生成而促進(jìn)T細(xì)胞分化，增加Th1細(xì)胞應(yīng)答，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。同時維生素D與其受體結(jié)合后也能夠產(chǎn)生LL-37。正常生理情況下，人體組織、體液LL-37的濃度為2～5 μg/ml，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥和病原體入侵時，LL-37的濃度會增加[21]。但是LL-37是否可以協(xié)助肺結(jié)核患者的治療，目前尚無報道。本研究結(jié)果也僅反應(yīng)出肺結(jié)核患者LL-37水平較健康人群高，且與病情嚴(yán)重程度存在一定相關(guān)性，提示LL-37可能是一種活動性炎癥性疾病的生物標(biāo)記物，其是否會給機(jī)體帶來免疫損傷及其具體免疫機(jī)制，目前仍不清楚。

本研究中尚未探討民族、季節(jié)等因素對檢測結(jié)果造成的影響，亦未研究維生素D與肺結(jié)核患者機(jī)體免疫的相關(guān)性，尚有許多工作需要進(jìn)一步深入。目前，中國結(jié)核病的防控工作面臨諸多挑戰(zhàn)，維生素D在結(jié)核病患者免疫反應(yīng)機(jī)制中的相關(guān)研究給臨床工作者帶來一些啟發(fā)，未來需要繼續(xù)深入分析維生素D在結(jié)核病患者免疫反應(yīng)機(jī)制中的作用。