王韶嶸綜述 高興春 陳芳妮 喬文偉 米亞靜審校

作者單位：710021西安醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院(王韶嶸，陳芳妮)；710021西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部(高興春，米亞靜)；710021西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院(喬文偉)

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著我們的健康，根據(jù)國家癌癥中心發(fā)布的全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2014年我國惡性腫瘤估計新發(fā)病例數(shù)380.4萬例(男性211.4萬例，女性169.0萬例)，2015年這一數(shù)字達(dá)到400萬。惡性腫瘤是由遺傳因素、環(huán)境因素及機(jī)體免疫系統(tǒng)等在內(nèi)的多種因素共同作用下所引發(fā)的，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前還不能完全闡明其具體機(jī)制。此外，惡性腫瘤的治療主要依賴于放、化療及手術(shù)治療，但對于放、化療均不耐受或已經(jīng)處于晚期、失去手術(shù)機(jī)會的患者仍然沒有一種有效且具有特異性的治療方法，這些導(dǎo)致惡性腫瘤患者的治愈率不高且預(yù)后極差。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)發(fā)展迅猛，具有廣泛的應(yīng)用前景，研究人員開創(chuàng)性地將其應(yīng)用到腫瘤的研究中，探索復(fù)雜的腫瘤表型與基因功能間的關(guān)系，為腫瘤的研究及治療提供了新的技術(shù)。

1 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)

1.1 CRISPR發(fā)展歷程

1987年，日本科學(xué)家在研究堿性磷酸酶基因時發(fā)現(xiàn)該基因編碼區(qū)下游存在一系列的重復(fù)片段(Repeats)，中間以非重復(fù)片段(Spacers)間隔相連。這些片段的長度在24～48 bp不等，具有二重對稱性，為其形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)提供基礎(chǔ)。2002年，Jansen等[1]首次明確定義了細(xì)菌基因組中的CRISPR/Cas9系統(tǒng)。在2005年研究人員又發(fā)現(xiàn)CRISPR中的很多間隔序列來源于質(zhì)粒或噬菌體外源DNA，因此提出了CRISPR/Cas系統(tǒng)可能是細(xì)菌的適應(yīng)性防御系統(tǒng)的假說[2]。2007年，Barrangou等[3]第1次通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR間隔序列可以通過與噬菌體相應(yīng)序列的匹配來發(fā)揮適應(yīng)性免疫反應(yīng)。隨后CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制逐漸被揭開，目前，CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種快速高效的基因編輯技術(shù)，已被應(yīng)用于人類細(xì)胞、小鼠、大鼠、斑馬魚、酵母、果蠅、現(xiàn)充、擬南芥、非洲爪蟾[4]等領(lǐng)域的研究中，發(fā)揮了不可忽視的作用。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制

根據(jù)核酸內(nèi)切酶的識別及切割機(jī)制的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)分成2類5型，共16個亞型[5-6]，在此主要介紹其中操作較為簡潔并且應(yīng)用廣泛的來源于釀膿性鏈球菌的2類Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

CRISPR RNA(crRNA)、反式激活CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA,tracrRNA)、Cas9蛋白是CRISPR/Cas9系統(tǒng)的3個重要組成要件。在外源DNA第1次入侵噬菌體或細(xì)菌時，CRISPR/Cas9系統(tǒng)會特異性的捕獲一段被稱為proto-spacers的外源DNA序列，整合入細(xì)菌CIRSPR序列形成位于目標(biāo)位點(diǎn)下游的間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)。當(dāng)同一外源DNA第2次進(jìn)入細(xì)菌時，CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)錄生成前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，在RNaseⅢ的作用下被加工成為成熟crRNA。crRNA的3' 端通過堿基互補(bǔ)配對與tracrRNA形成雙鏈二級結(jié)構(gòu)-R環(huán)，引導(dǎo)Cas9蛋白聚集在其周圍形成CRISPR核糖核蛋白復(fù)合體。復(fù)合體中crRNA的5' 末端特異性識別目標(biāo)序列，同時識別PAM的NGG位點(diǎn)后，CRISPR/Cas9對外源DNA進(jìn)行靶向切割，形成DNA雙鏈缺口(doubt strand breaks,DSBs)。DNA在自我修復(fù)的過程中優(yōu)先使用易出現(xiàn)失誤的非同源末端連接(nonhomologous end-joining，NHEJ)，錯誤地引入堿基使DNA發(fā)生突變，就完成了基因敲除的目的。在切割過程中，PAM位點(diǎn)通常作為識別位點(diǎn)存在，而更重要的是PAM位點(diǎn)還是區(qū)別自身DNA與外源DNA防止發(fā)生自身免疫的識別位點(diǎn)。隨著研究的深入，研究人員用單鏈導(dǎo)向RNA(sgRNA)代替crRNA與tracrRNA形成的R環(huán)，同樣可以實(shí)現(xiàn)Cas9蛋白對目標(biāo)基因定點(diǎn)切割的目的。

1.3 CRISPR與其他基因編輯技術(shù)的比較

除新型的CRISPR/Cas9技術(shù)外，基因編輯技術(shù)還有ZFN和TALEN。ZFN和TALEN作為基因編輯技術(shù)中不可或缺的方法，至今仍被廣泛應(yīng)用，而CRISPR/Cas9技術(shù)作為新型基因編輯技術(shù)，有其自身的優(yōu)勢：①可編輯位點(diǎn)多。理論上，在基因組中每8 bp就有1個合適CRISPR/Cas9編輯的位點(diǎn)[7]，分布頻率高，而對于ZFN和TALEN，在基因組中平均要500 bp和125 bp才會有1個合適的編輯位點(diǎn)。②切割復(fù)合體簡單。針對于不同的基因序列，ZFN需要設(shè)計不同的識別結(jié)構(gòu)域，不僅操作復(fù)雜，還耗費(fèi)時間、人力和財力；而CRISPR/Cas9技術(shù)只需要一段sgRNA即可識別目的序列發(fā)揮基因編輯作用。③可同時進(jìn)行多個位點(diǎn)基因的編輯。研究者可以設(shè)計多條sgRNA引導(dǎo)序列，同時導(dǎo)入目的細(xì)胞即可同時編輯多個靶位點(diǎn)。有研究報道[8-10]，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠和斑馬魚中可以同時編輯5個基因，在大鼠細(xì)胞中可以同時編輯3個基因。而ZFN和TALEN技術(shù)大多只針對1個目標(biāo)靶點(diǎn)進(jìn)行編輯，就這方面而言，CRISPR/Cas9編輯技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新出現(xiàn)的一種基因編輯技術(shù)具有操作簡便、快速省時等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被研究人員廣泛應(yīng)用到腫瘤的研究及治療中，并取得了令人鼓舞的結(jié)果。

2.1 建立癌癥動物模型

癌癥動物模型的建立是研究癌癥相關(guān)基因功能的一個重要手段。在傳統(tǒng)的動物模型建立中，研究人員的技術(shù)操作僅限于受精卵水平，利用同源重組技術(shù)對胚胎干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯。例如，研究人員通過一系列ES細(xì)胞操做或原核注射等方式對小鼠進(jìn)行基因改造，篩選產(chǎn)生生殖系嵌合體的小鼠，進(jìn)而培育出單基因敲除的小鼠。但是這種方法存在很多問題：獲得敲除小鼠的時限較長、飼養(yǎng)小鼠的成本高昂等。此外，不能同時在小鼠或者ES細(xì)胞中引入多種修飾基因，這仍然是限制該方法在疾病研究應(yīng)用中的一大阻礙[11]。而CRISPR/Cas9技術(shù)則極大地簡化了癌癥動物模型的建立，該技術(shù)不需要建立復(fù)雜的ES細(xì)胞系，極大程度地縮短了時限、縮減了成本。2013年，Jenisch團(tuán)隊(duì)證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在單個步驟中可以在小鼠ES細(xì)胞中同時編輯5對(Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty-8)基因，為獲得攜帶目的基因的小鼠提供了便利。

此外，科學(xué)家首次利用水流動力學(xué)注射，通過小鼠尾靜脈向野生型小鼠體內(nèi)注射包含Cas9和gRNAs的質(zhì)粒，靶向敲除肝細(xì)胞內(nèi)的抑癌基因PTEN和p53，快速地獲得了患有肝癌的小鼠模型，有利于肝癌機(jī)制的研究的開展[12]。同年，在成功構(gòu)建肝癌模型后，張峰團(tuán)隊(duì)及Phillip A.Sharp團(tuán)隊(duì)的Sidi Chen等又成功構(gòu)建了小鼠肺癌模型[13]，他們首先利用Cre-loxP系統(tǒng)將Cas9基因敲入小鼠體內(nèi)，構(gòu)建Cas9小鼠模型后，將篩選出來的3個基因：KRAS、p53、LKB1基因的sgRNA分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，迅速獲得肺腺癌小鼠模型。

人們對于腦瘤的發(fā)病機(jī)制缺乏了解，導(dǎo)致對腦瘤的治療不能達(dá)到令人滿意的效果。2016年，Mao等首次利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立了小鼠腦瘤模型，改善了傳統(tǒng)腦瘤動物模型中存在的問題，能夠更精確地進(jìn)行腦瘤相關(guān)靶點(diǎn)的研究。同時，實(shí)驗(yàn)中還確定了13種與腦瘤發(fā)病密切相關(guān)的一些調(diào)節(jié)因子(p53、Nf1、Pten、Ptech1、Bmi1、Met、Notch1、CDK6、miR-10b、TERT、LSD1、miR-218、miR-128)[14]。

2.2 癌癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究

在腫瘤的研究進(jìn)程中，運(yùn)用離體細(xì)胞培養(yǎng)的方式來研究腫瘤的發(fā)病機(jī)制是必不可少的。CRISPR/Cas9技術(shù)使得研究者可以更方便、更快捷地獲得腫瘤細(xì)胞系。在早期的研究中，研究者利用Cas9蛋白切割靶DNA，DNA雙鏈發(fā)生斷裂后有2種修復(fù)方式：非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源末端連接(homologous directed repair，HDR)，其中NHEJ修復(fù)后產(chǎn)生插入或缺失突變，使DNA雙鏈發(fā)生移碼突變或無義突變，從而達(dá)到敲除基因的目的。汪超甲等[15]利用CRISPR/Cas9表達(dá)載體敲除了在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)的Pyk2，抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，揭示了其在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的作用，為未來治療膠質(zhì)瘤提供了理論基礎(chǔ)。

為了進(jìn)一步提高CRISPR-Cas9系統(tǒng)的有效性，拓展CRISPR/Cas9系統(tǒng)在其他方面的應(yīng)用。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)了一種Cas9蛋白的突變體Nuclease-dead Cas9(dCas9)，這是一種喪失了核酸酶活性的Cas9蛋白，通過與DNA序列的結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄過程，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對基因表達(dá)的抑制作用。這種具有dCas9的CRISPR系統(tǒng)被稱為CRISPR干擾(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeat interference， CRISPRi)技術(shù)。該系統(tǒng)提供兩種不同的功能，一種為dCas9介導(dǎo)的抑制作用CRISPRi(例如KRAB)，另一種為dCas9介導(dǎo)的激活CRISPRa(例如VP16和VP64)[16]。利用這2個功能研究人員不僅可以通過敲除基因探究基因功能，還可以通過dCas9激活技術(shù)篩選、鑒定原癌基因，有助于發(fā)現(xiàn)新的基因治療靶點(diǎn)[17-19]，為未來腫瘤機(jī)制的研究提供重要的基礎(chǔ)。

3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤治療中的應(yīng)用

3.1 基因修復(fù)及敲除

在腫瘤細(xì)胞形成的過程中，原癌基因的激活與抑癌基因的沉默均可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?；謴?fù)、提高抑癌基因的表達(dá)，就成為了一種治療腫瘤的新思路。慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML) 的發(fā)生常與體內(nèi)抑癌基因ASXL1的突變有關(guān)，并且影響患者的預(yù)后。Simona等[20]利用CRISPR/Cas9技術(shù)靶向修復(fù)了KBM5細(xì)胞中ASXL1的無效突變，顯著降低了KBM5細(xì)胞的增殖速率，增強(qiáng)了細(xì)胞的分化，并且經(jīng)過ASXL1基因修復(fù)的荷瘤小鼠的生存時間較未經(jīng)ASXL1修復(fù)的荷瘤小鼠生存時間長。

此外，由于表觀遺傳學(xué)在腫瘤發(fā)生中的重要作用，通過表觀遺傳學(xué)與CRISPR/Cas9系統(tǒng)影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因的表達(dá)，可能成為未來很有價值的一種腫瘤治療手段。例如，表觀遺傳修飾與dCas9融合或由scRNA招募到目標(biāo)位點(diǎn)，通過改變目標(biāo)位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)或者以特定的方式影響其對組蛋白的修飾，實(shí)現(xiàn)對腫瘤進(jìn)行治療的目的。

3.2 打破機(jī)體免疫耐受

腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)通過對自身的組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)進(jìn)行修飾從而建立免疫耐受，逃逸免疫系統(tǒng)的殺傷，因此研究人員通過打破其免疫耐受實(shí)現(xiàn)治療的目的。目前腫瘤細(xì)胞免疫治療的方法包括：特異性T細(xì)胞受體修飾的T細(xì)胞治療(TCR-T)和嵌合抗原受體修飾的T細(xì)胞治療(CAR-T)。這兩種免疫治療方法都是通過在T細(xì)胞的表面表達(dá)特異性受體，從而發(fā)生特異性識別、殺傷靶細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)，其中CAR-T技術(shù)在治療血液腫瘤和非霍奇金淋巴瘤上有顯著療效。但這種方法會導(dǎo)致CAR基因隨機(jī)插入到受體細(xì)胞的基因組上，可能引起遺傳副作用的發(fā)生。因此，2017年Eyquem Justin等利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了新一代CAR-T細(xì)胞[21]。CRRISPR/Cas9系統(tǒng)通過編輯T細(xì)胞中的TRAC(T-cell receptor a constant)基因，將CAR基因特異性地插入到受體細(xì)胞基因組，避免了遺傳副作用的發(fā)生、增強(qiáng)了T細(xì)胞的效力，并且延遲了效應(yīng)T細(xì)胞的耗竭。這一結(jié)果也在急性淋巴細(xì)胞白血病的小鼠模型中得到了驗(yàn)證。

此外，研究人員還利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)敲除PDCD1基因?qū)崿F(xiàn)了腫瘤免疫治療。在人體腫瘤微環(huán)境中，程序性死亡受體(programmed cell death protein 1，PD-1)是由PDCD1基因編碼的產(chǎn)物，在人體抗腫瘤免疫應(yīng)答機(jī)制中起負(fù)向調(diào)節(jié)的功能，通過阻斷PD-1與其受體PD-L1的結(jié)合，增強(qiáng)人體T細(xì)胞的激活來發(fā)揮其生物作用。2017年，陳艷新等[22]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除人體T細(xì)胞系HuT-78中PDCD1基因，下調(diào)了PD-1的表達(dá)，因而減弱了PD-1/PD-L1信號通路對細(xì)胞免疫功能的抑制作用，使T細(xì)胞對腫瘤的殺傷能力不受影響，為未來腫瘤的免疫學(xué)治療提供有力的技術(shù)支持。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)在未來腫瘤研究及治療方面的發(fā)展?jié)摿κ菬o限的， 但是我們必須清醒地認(rèn)識到，這項(xiàng)技術(shù)還存在很多尚未解決的問題，比如嚴(yán)重的脫靶效應(yīng)，應(yīng)用于人體時的倫理問題、安全性問題等。但可以預(yù)見的是，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷創(chuàng)新最終會解決上述難題，為腫瘤的治療研究提供新的思路和方向，為腫瘤患者帶去新希望。