李一，黃婷，楊麟瀚，吳池華

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院，成都 610072)

乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一，是所有腫瘤死亡的第五大原因[1]。世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[2]顯示，截至2018年全球乳腺癌新發(fā)病例約為138萬例，占所有新發(fā)腫瘤病例的23%，我國(guó)每年新發(fā)乳腺癌病例和相關(guān)死亡人數(shù)分別占世界的12.2%和9.6%，并且發(fā)病率以每年2%的趨勢(shì)增長(zhǎng)，到2021年中國(guó)估計(jì)將有250萬人患乳腺癌。雖然早期檢查和診斷技術(shù)的改進(jìn)以及手術(shù)和綜合輔助治療的進(jìn)步已經(jīng)顯著改善了患者的預(yù)后，但乳腺癌患者的總體生存率仍然不理想[3，4]。乳腺癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，但隨著對(duì)乳腺癌生物學(xué)機(jī)制的深入理解，其分子靶向治療逐漸成為可能[5]。Ras相關(guān)區(qū)域家族1異構(gòu)體A(RASSF1A)屬于RAS效應(yīng)子家族，其編碼一種支架蛋白，通過促進(jìn)多種效應(yīng)蛋白復(fù)合物的組裝來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)通路[6]。研究[7～10]顯示，RASSF1A基因在多種腫瘤中被報(bào)道為抑癌基因，包括非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等，在乳腺癌中RASSF1A基因發(fā)生高甲基化，可能是乳腺癌的潛在診斷標(biāo)志物。本研究在細(xì)胞水平觀察了RASSF1A基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7增殖、凋亡和體內(nèi)成瘤能力的影響，探討RASSF1A基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用機(jī)制，為RASSF1A成為治療乳腺癌潛在藥物靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑、儀器及裸鼠 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫；RASSF1A過表達(dá)慢病毒oe-RASSF1A、空白載體慢病毒vector購自上海漢恒生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基和FBS購自美國(guó)Gibco公司；培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板等購自美國(guó)Coring公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒等購自日本TaKaRa公司；MTS購自北京百奧萊博生物科技有限公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購自北京索萊寶生物科技有限公司；磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)抗體(ab32089)、磷酸化PI3K(pPI3K)抗體(ab127617)、蛋白激酶B(AKT)抗體(ab179463)和磷酸化AKT(pAKT)抗體(ab38449)購自英國(guó)abcam公司；裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、慢病毒載體感染及分組 取MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度為90%左右時(shí)，按1∶2的比例進(jìn)行傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔鋪至6孔板中，細(xì)胞貼壁后將RASSF1A過表達(dá)慢病毒oe-RASSF1A和空白載體慢病毒vector與含有5 μg/mL病毒感染增強(qiáng)液的無血清培養(yǎng)基混勻后加入各組細(xì)胞中，分別記為oe-RASSF1A組、vector組。

1.3 兩組細(xì)胞中RASSF1A mRNA的檢測(cè) 采用qRT-PCR法。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列如下：RASSF1A正向引物為5′-GTAATGGAAATTTGGGTGTAGGGAT-3′,反向引物為5′-CTAACAACCCAAAATAACAAAACCA-3′；β-actin引正向引物為5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,反向引物為5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中RASSF1A mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 兩組細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTS法。取兩組細(xì)胞以每孔3 000個(gè)接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)，更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，并加入20 μL MTS檢測(cè)試劑，37 ℃孵育2 h后，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在490 nm處的吸光度(OD)值，以O(shè)D值表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 兩組細(xì)胞周期觀察 采用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞加入預(yù)冷的70%酒精4 ℃固定12 h，重懸于500 μL染色緩沖液中，然后分別加入250 μL PI和10 μL RNase A染液，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期，計(jì)算各細(xì)胞周期比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.6 兩組細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)細(xì)胞重懸于500 μL染色緩沖液中，然后分別加入5 μL FITC和5 μL PI染液，37 ℃避光孵育30 min，采用流式細(xì)胞儀測(cè)算細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.7 兩組細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力觀察 采用皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，胰酶消化收集，PBS清洗3次后計(jì)數(shù)，取1×107個(gè)細(xì)胞重懸于100 μL PBS中。取4周齡雌性裸鼠10只，分成2組，分別在右側(cè)腋下注射重懸后的兩組細(xì)胞，常規(guī)飼養(yǎng)4周后處死裸鼠，解剖瘤體并稱重，以瘤體重表示細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力。所有操作均符合動(dòng)物倫理學(xué)。

1.8 兩組細(xì)胞中RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT和pAKT蛋白檢測(cè) 采用Western Blotting法。兩組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，完全裂解后4 ℃、12 000 r/min離心20 min，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，煮沸變性后進(jìn)行SDS電泳，蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫經(jīng)8%牛奶封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗3次，二抗室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光條帶，采用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組細(xì)胞中RASSF1A mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 oe-RASSF1A組細(xì)胞中RASSF1A mRNA相對(duì)表達(dá)量為13.25±3.20，vector組細(xì)胞中RASSF1A mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.03，兩組相比，P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞增殖能力比較 oe-RASSF1A組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)的OD值分別為0.36±0.02、0.53±0.06、0.74±0.13、0.91±0.07，vector組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)的OD值分別為0.35±0.03、0.62±0.14、0.95±0.08、1.34±0.21，其中，在培養(yǎng)72、96 h時(shí)兩組的OD值相比，P均<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞周期比較 oe-RASSF1A組細(xì)胞處于G0/G1期、S期、G2/M期的比例分別為60.02%±3.21%、18.30%±2.31%、22.11%±1.03%，vector組細(xì)胞處于G0/G1期、S期、G2/M期的比例分別為63.67%±4.16%、21.04%±2.65%、15.32%±2.52%，其中oe-RASSF1A組細(xì)胞處于G2/M期的比例與vector組相比，P<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞凋亡率比較 oe-RASSF1A組細(xì)胞凋亡率為24.38%±5.80%，vector組細(xì)胞凋亡率為4.25%±0.92%，兩組相比，P<0.05。

2.5 兩組細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力比較 注射oe-RASSF1A組細(xì)胞的裸鼠成瘤的瘤體重為63.29±14.03 mg，注射vector組細(xì)胞的裸鼠成瘤的瘤體重為104.58±17.52 mg，兩組相比，P<0.05。

2.6 兩組細(xì)胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT和pAKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 oe-RASSF1A組細(xì)胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為8.67±1.32、0.86±0.21、0.26±0.15、0.91±0.11、0.30±0.07，vector組細(xì)胞RASSF1A、PI3K、pPI3K、AKT、pAKT蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.05±0.04、1.00±0.00、1.01±0.01、1.04±0.04、1.00±0.00，其中，兩組細(xì)胞RASSF1A、pPI3K、pAKT蛋白相對(duì)表達(dá)量相比，P均<0.05。

3 討論

乳腺癌是一種起源于乳腺導(dǎo)管上皮或乳腺小葉的惡性腫瘤，其發(fā)病率占女性所有腫瘤的30%，常見發(fā)病年齡為20～59歲之間，其死亡率占女性腫瘤相關(guān)死亡原因的第一位，已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題[11]。乳腺癌是一組具有不同臨床和組織學(xué)形式的異質(zhì)性疾病，雖然對(duì)其發(fā)病機(jī)理在不斷的研究，但是其致病機(jī)制尚未完全闡明，進(jìn)一步在分子水平了解其發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找有效的藥物作用靶點(diǎn)，對(duì)更好的治療乳腺癌具有重要的意義。目前最常用于對(duì)抗乳腺癌的策略包括手術(shù)切除病灶、放射治療、輔助化療、激素治療和靶向治療。近年來，乳腺癌的診斷和治療取得了很大進(jìn)展，尤其是乳腺癌的外科治療，但是乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率很高，手術(shù)對(duì)于晚期患者治療效果有限[3,12]。紫杉醇、雌激素受體的部分激動(dòng)劑他莫昔芬和多柔比星等化療藥物均是治療乳腺癌的有效藥物，但在對(duì)抗乳腺癌時(shí)最大的挑戰(zhàn)是腫瘤細(xì)胞的化學(xué)抗性，化療藥物對(duì)乳腺癌晚期患者治療效果不佳[4,13]。目前乳腺癌治療的主要研究方向是靶向藥物治療，其毒副作用較低、安全性較高，曲妥珠單抗、拉帕替尼和貝伐單抗等靶向藥物均取得了顯著的療效[5]，但是乳腺癌患者的預(yù)后并未達(dá)到理想的效果，因此開發(fā)新的有效分子靶向藥物非常關(guān)鍵。

RASSF1A基因位于染色體3p21.3上，廣泛表達(dá)于各種正常組織，而在腫瘤組織中常表達(dá)缺失，是一種抑癌基因。研究[14]顯示，RASSF1A基因的耗竭是腫瘤起始和進(jìn)展的基礎(chǔ)。RASSF1A是RASSF(RAS關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域)家族成員之一，可與活化的K-RAS形成內(nèi)源性復(fù)合物，但是RASSF1A沒有酶活性，充當(dāng)K-RAS調(diào)節(jié)的支架，將K-RAS連接到多種信號(hào)傳導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)[15]。RASSF1A屬于RASSF家族中研究較多的成員，在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等人類腫瘤細(xì)胞中觀察到RASSF1A基因發(fā)生表觀遺傳沉默[7，8]。已報(bào)道的研究[16]中，RASSF1A基因可刺激有絲分裂停滯、DNA修復(fù)和細(xì)胞凋亡，并控制細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移。研究[17]顯示，RASSF1A基因在正常乳腺細(xì)胞中表達(dá)，在正常乳腺組織中顯示8%的啟動(dòng)子高甲基化，而在乳腺癌組織中高達(dá)56%的啟動(dòng)子發(fā)生高甲基化，RASSF1A發(fā)生DNA甲基化而表達(dá)降低在乳腺癌中較為常見，越來越多的研究表明RASSF1A和乳腺癌密切相關(guān)。本研究采用慢病毒技術(shù)增加乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中RASSF1A的表達(dá)，觀察RASSF1A對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RASSF1A在體外抑制MCF-7細(xì)胞的增殖活性，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并促使細(xì)胞發(fā)生凋亡，在體內(nèi)抑制MCF-7細(xì)胞的成瘤能力，表明RASSF1A通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

已經(jīng)觀察到RASSF1A對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，其具體的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。研究[18]發(fā)現(xiàn)，RASSF1A是RAS效應(yīng)因子，在K-RAS的影響下，RASSF1A可以結(jié)合凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白MOAP-1，MOAP-1通過結(jié)合并激活促凋亡執(zhí)行因子BAX發(fā)揮作用。RASSF1A還結(jié)合MST(Hippo)激酶以將K-RAS連接到Hippo信號(hào)途徑[19]。此外RASSF1A可通過引起鳥嘌呤核苷酸交換因子1(GEF-H1)、RhoB失活發(fā)揮功能[20]。K-RAS引起Ras癌基因突變的激活，活化的RAS被認(rèn)為主要通過結(jié)合和激活三種主要類型的促有絲分裂效應(yīng)蛋白：RAF激酶、PI3K和RALGEF家族來發(fā)揮作用，以刺激促生長(zhǎng)和存活信號(hào)途徑[21]。其中PI3K的激活導(dǎo)致促有絲分裂脂質(zhì)的刺激和AKT信號(hào)途徑的激活。研究[22]顯示，PI3K/AKT信號(hào)途徑是調(diào)控腫瘤增殖和凋亡的重要通路之一，在乳腺癌中PI3K/AKT信號(hào)途徑異常激活，可作為抗腫瘤藥物治療乳腺癌抑制信號(hào)通路之一[23]。Li等[24]在有關(guān)肝細(xì)胞肝癌的研究中報(bào)道，RASSF1A通過抑制PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)自噬。我們推測(cè)，RASSF1A可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用。本研究結(jié)果顯示，過表達(dá)RASSF1A后，MCF-7細(xì)胞中PI3K和AKT總蛋白無明顯變化，發(fā)生磷酸化作用的pPI3K和pAKT蛋白表達(dá)降低，表明RASSF1A可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路而在乳腺癌中發(fā)揮重要功能。

綜上所述，RASSF1A可能通過抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。RASSF1A在乳腺癌中為抑癌基因，具有成為乳腺癌治療藥物靶點(diǎn)的潛力。