李 穎, 王 晴, 徐瑾業(yè), 丁冬怡, 李 含,朱儷安, 袁玉剛, 王小洪

(揚州大學醫(yī)學院, 江蘇 揚州, 225001)

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要癥狀是靜止性震顫、運動遲緩、步態(tài)失調(diào)、肌肉強直等運動功能障礙。抑郁是帕金森病最常見的非運動癥狀，臨床癥狀表現(xiàn)為認知功能減退、興趣缺失、快感下降等。抑郁在帕金森病患者的發(fā)病率達到50%～70%, 不僅影響患者的生存和生活質量，更加重了帕金森病患者的運動功能障礙。目前多數(shù)動物實驗集中在PD模型的機制與治療，而帕金森病抑郁(PDD)的動物模型的研究尚少。本研究對目前存在的PDD動物模型的建立方法、發(fā)病機制及評估方法等研究綜述如下。

1 PDD的發(fā)病機制

1.1 神經(jīng)遞質異常學說

目前越來越多的研究表明神經(jīng)遞質在PDD的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。多種假說被普遍認可，如去甲腎上腺素學說、5-羥色胺(5-HT)學說等。

1.1.1 多巴胺: 帕金森病患者腦內(nèi)主要的病理改變就是多巴胺(DA)能神經(jīng)元的大量選擇性喪失[1], PDD患者腦內(nèi)DA水平顯著低于正常人，針對DA受體的治療能明顯改善帕金森病患者的抑郁狀態(tài)。DA在情緒活動中有重要的調(diào)控作用，推測DA在PDD的發(fā)生、發(fā)展中可能起著至關重要的作用。本實驗室使用1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP)和慢性輕或中度應激共同暴露的方法成功建立帕金森病伴發(fā)抑郁的小鼠模型，結果顯示MPTP注射后應激暴露組的小鼠腦內(nèi)DA水平較正常組及PD組小鼠均顯著下降，且下降程度具有應激程度的依賴性。

1.1.2 γ-氨基丁酸(GABA): GABA是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質，主要存在于中腦黑質區(qū)。GABA的水平異常及GABA受體功能障礙與癲癇、阿爾茲海默癥、抑郁癥等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生、發(fā)展有關。研究[2]發(fā)現(xiàn)PDD患者血漿GABA水平顯著高于正常人，可見GABA水平異常與PDD的發(fā)生、發(fā)展有著密不可分的關系。此外，各型GABA受體、GABA與其他神經(jīng)遞質(谷氨酸、DA等)的相互作用也在PDD的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用。本實驗室用MPTP腹腔注射和慢性輕或中度應激共同暴露的方法建立PDD小鼠模型，PCR法檢測各組小鼠前額葉內(nèi)GABA受體的表達量，結果顯示PDD小鼠腦內(nèi)GABA水平顯著升高，而海馬區(qū)無明顯改變。

1.1.3 去甲腎上腺素(NE): NE屬于兒茶酚胺類神經(jīng)遞質, NE功能低下學說是抑郁發(fā)病的機制之一。黑質區(qū)多巴胺能神經(jīng)元系統(tǒng)與基底節(jié)及其他部位的神經(jīng)遞質存在一定的關聯(lián)，嚴重的多巴胺能神經(jīng)元缺失導致去甲腎上腺素系統(tǒng)功能的障礙。已有學者[3]就神經(jīng)遞質的協(xié)同與拮抗作用在PDD的發(fā)展中的作用展開研究, NE能神經(jīng)元功能障礙導致去甲腎上腺素及5-HT分泌減少，從而導致抑郁的發(fā)生。

1.2 5-HT系統(tǒng)功能異常學說

1.2.1 5-HT系統(tǒng)在PDD發(fā)展中的作用: 5-HT系統(tǒng)功能障礙是抑郁發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。研究表明, PD患者腦脊液中5-HT的代謝產(chǎn)物5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)水平明顯高于健康人，而Mayeux 等[4]研究發(fā)現(xiàn)PD伴重度抑郁的患者腦脊液中5-HIAA 水平顯著高于PD無抑郁癥狀的患者。PD尸檢和MPTP誘導的PD猴模型病理學[5]檢測發(fā)現(xiàn)，二者皮質區(qū)和皮質下基底核區(qū)5-HT和5-HIAA的水平也顯著下降，且PD患者尾狀核內(nèi)5-HT和5-HIAA水平的下降與抑郁癥狀密切相關。PD中黑質-紋狀體通路的DA系統(tǒng)損傷會導致5-HT系統(tǒng)功能障礙，兩種系統(tǒng)可能存在復雜的相互作用關系。Zhang等[6]研究則發(fā)現(xiàn)，在不同亞型的MPTP PD小鼠模型中，其腦內(nèi)的5-HT水平及行為學表現(xiàn)存在顯著的差異: MPTP急性PD小鼠存在顯著的5-HT水平降低，曠場實驗中表現(xiàn)為行走路程顯著降低等抑郁行為; 亞急性模型小鼠則出現(xiàn)較正常小鼠顯著的行為活躍的現(xiàn)象，有學者認為這是多巴胺能神經(jīng)元嚴重損傷導致的5-HT系統(tǒng)嚴重障礙而出現(xiàn)的一過性代償表現(xiàn)，但具體的發(fā)生機制有待進一步深入研究。另外，給6-羥基多巴胺(6-OHDA)誘導的PD模型大鼠腹腔注射左旋多巴(L-Dopa)后，大鼠前額葉、杏仁體、海馬等腦區(qū)5-HT的水平顯著升高[7]。以上動物模型數(shù)據(jù)表明, DA和5-HT兩種神經(jīng)遞質系統(tǒng)在PDD發(fā)生、發(fā)展的過程中存在一定的相互作用。

1.2.2 PDD中5-羥色胺受體功能的改變: 5-HT從神經(jīng)末梢釋放后與5-羥色胺受體結合發(fā)揮特定的生物學效應，目前已經(jīng)確定7種5-羥色胺受體(5-HT1-7R), 每種包含多種亞型。每個腦區(qū)表達的亞型種類不同，其發(fā)揮的生物學作用也不一致。一項11C-DASB PET頭部掃描結果發(fā)現(xiàn)，小部分PDD患者背外側和前額葉皮質的5-羥色胺受體結合率升高，且PDD患者的扣帶回、中縫核尾端也出現(xiàn)5-羥色胺受體結合率升高的現(xiàn)象。Zhang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射MPTP 7 d后，有抑郁癥狀的小鼠腦內(nèi)5-HT2B受體水平顯著下降，而無抑郁癥狀的PD小鼠無明顯改變。本實驗室利用腹腔注射MPTP結合慢性輕或中度應激刺激的方法建立PDD小鼠模型，結果顯示PDD小鼠腦內(nèi)5-HT水平較正常組小鼠顯著下降，且MPTP注射結合慢性中度應激暴露的小鼠腦內(nèi)5-HT水平下降最為明顯。PDD小鼠前額葉5-羥色胺5a受體(5-HT5aR)、5-羥色胺5b受體(5-HT5bR)、5-羥色胺6受體(5-HT6R)水平顯著降低，而海馬區(qū)各5-HT受體水平則無明顯改變。

1.2.3 PDD中5-羥色胺系統(tǒng)功能障的腦區(qū): ① 中縫核區(qū): 中縫核區(qū)5-HT能神經(jīng)元損傷在帕金森病的進展中發(fā)揮重要作用。中縫核尾側區(qū)的5-HT能神經(jīng)元與帕金森病中疼痛、胃腸功能紊亂等非運動性癥狀有密切關系。研究[9]發(fā)現(xiàn)，帕金森病重度抑郁患者經(jīng)顱超聲檢查中發(fā)現(xiàn)中縫核區(qū)低密度陰影，且低回聲區(qū)面積大小與患者的抑郁程度呈正比。PDD患者的磁共振檢查發(fā)現(xiàn)腦干中縫核區(qū)的勻質性較無抑郁癥的PD患者顯著下降，乃是PDD患者該腦區(qū)中大量神經(jīng)元變性死亡所致[10]。Prinz等[11]研究發(fā)現(xiàn), 6-OHDA大鼠模型中背側和腦干中縫核區(qū)的5-HT能神經(jīng)元激活增加，而PD大鼠對5-HT受體激動劑的反應性降低。上述研究表明，中縫核區(qū)的5-HT系統(tǒng)功能障礙參與了PDD的發(fā)生與發(fā)展。② 丘腦底核區(qū): 丘腦底核分為感覺運動區(qū)、聯(lián)絡區(qū)和邊緣區(qū)3個功能區(qū)，邊緣區(qū)域通過與丘腦、杏仁核和藍斑等結構聯(lián)系參與調(diào)控抑郁行為。丘腦底核接受來自中縫背核的5-HT能纖維支配，主要表達5-HT1A、5-HT1B、5-HT2C和5-HT4受體亞型。膜片鉗研究[12]結果發(fā)現(xiàn), 5-HT可激活5-HT2C和5-HT4 受體而增加神經(jīng)元放電頻率, 5-HT1A受體激活則降低放電頻率。Beyeler等[13]證實注射5-HT2C受體激動劑后，大鼠內(nèi)側丘腦底核等邊緣區(qū)域的Fos表達增加，其他區(qū)域無明顯改變。高頻電刺激丘腦底核治療帕金森病患者運動癥狀的同時，產(chǎn)生抑郁的行為學改變。

1.3 神經(jīng)炎癥

炎癥是PD重要的病因，參與了帕金森病的進展過程。大量臨床和實驗學數(shù)據(jù)[14]表明, PD患者和動物模型腦內(nèi)出現(xiàn)小膠質細胞激活，炎癥介質如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)等的水平顯著升高。PD小鼠模型體內(nèi)的周圍性炎癥使其血腦屏障通透性增加，進而加劇腦內(nèi)一系列免疫炎性反應，使DA、5-HT及NE能神經(jīng)元變性死亡[14]。同時，持續(xù)的腦內(nèi)炎癥反應對神經(jīng)元功能及神經(jīng)元再生起負調(diào)節(jié)作用，參與PDD的病理、生理過程[14]。長期腹腔注射LPS制作模擬PD炎癥的小鼠模型，懸尾實驗和強迫游泳等行為學結果顯示這種PD小鼠模型中存在顯著的抑郁癥狀[15]。長期給予小鼠炎癥介質IL-1后，小鼠腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的基因和蛋白水平都顯著下降，表明炎癥介質能加速神經(jīng)元的損傷[15]。腦內(nèi)海馬齒狀回和腦室下區(qū)存在神經(jīng)元發(fā)生的情況能緩解PDD的抑郁癥狀。腦內(nèi)炎癥反應產(chǎn)生的炎癥介質可以通過激活轉錄因子如糖皮質激素受體從而使成年患者海馬區(qū)域的神經(jīng)發(fā)生降低，加劇PDD的癥狀。

2 帕金森病抑郁的動物模型

PD動物模型大部分同時伴有抑郁癥狀，可被篩選為PDD模型。另外，研究者們在經(jīng)典的PD動物模型中施加一定的不可預見性刺激因素，可誘導出模擬PD患者的抑郁癥狀。

2.1 MPTP誘導的PDD模型

研究[16]發(fā)現(xiàn)，大鼠連續(xù)腹腔注射MPTP 12～18 d后發(fā)生了液體消耗總量降低、消耗蔗糖減弱、體質量減輕、強迫游泳實驗靜止時間增加等癥狀，證明MPTP可誘導大鼠產(chǎn)生抑郁癥狀。Marta G等[17]以鼠尾懸浮和蔗糖偏愛等實驗檢測MPTP誘導的急性PD小鼠的行為學表現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)小鼠產(chǎn)生抑郁癥狀。研究[16]表明，66.7%的亞急性PD嚙齒類動物模型存在抑郁癥狀。小鼠連續(xù)腹腔注射5周MPTP建立慢性PD小鼠模型，并發(fā)現(xiàn)該種慢性PD小鼠具有穩(wěn)定的抑郁癥狀[18]。MPTP誘導的PD模型動物中出現(xiàn)的抑郁癥狀較輕且不穩(wěn)定，不易出現(xiàn)病理特征。

慢性不可預見性應激(CUMS)是通過隨機給予實驗動物傾斜動物籠、潮濕墊料、強光照射、冰水游泳等10余種慢性刺激來建立抑郁動物模型。近年來，許多實驗使用神經(jīng)毒素和CUMS共同暴露的方法建立抑郁動物模型。Udaiyappan等[14]發(fā)現(xiàn)，與CUMS或MPTP單獨暴露的小鼠相比, CUMS和MPTP共同暴露的方法構建的PDD模型抑郁癥狀更顯著, 5-HT降低更明顯，氧化應激和炎癥反應更為嚴重，黑質紋狀體區(qū)中BDNF水平均顯著下降。同時，此研究在共同暴露組中，還設計了MPTP暴露前應激、MPTP暴露后應激以及MPTP暴露前后均應激3組。與MPTP暴露前應激和暴露前后均應激組相比, MPTP應激后CUMS暴露組小鼠表現(xiàn)出的運動量減少最顯著，炎癥反應和氧化應激相關蛋白水平降低均最顯著，這表明MPTP暴露后CUMS應激能產(chǎn)生顯著且穩(wěn)定的抑郁狀態(tài)。神經(jīng)毒素和CUMS共同暴露建立的PDD動物模型抑郁癥狀顯著，但其癥狀較臨床PDD患者的癥狀較重，且病死率高。

2.2 6-OHDA誘導的PDD模型

Santiago等[19]發(fā)現(xiàn), 6-OHDA除可產(chǎn)生帕金森病行為學特征以外，還可產(chǎn)生抑郁癥狀; 同時，其還發(fā)現(xiàn)6-OHDA大鼠模型的抑郁行為并不穩(wěn)定，表現(xiàn)為術后14 d蔗糖偏好增強，而抑郁癥狀在第21天后才明顯地表現(xiàn)出來。

目前，常在大鼠腦部立體注射6-OHDA建立PD模型后給予CUMS誘導產(chǎn)生抑郁癥狀。邢紅霞等[20]利用大鼠腦內(nèi)注射6-OHDA制作PD模型后，給予急性應激和CUMS制作不同類型的PDD模型，發(fā)現(xiàn)PD大鼠合并急、慢性應激后均表現(xiàn)出抑郁癥狀，尤其是PD大鼠合并CUMS的抑郁癥狀最為顯著。由此可見，大鼠腦部立體注射6-OHDA結合CUMS可誘導出穩(wěn)定的帕金森病抑郁癥狀，但此模型是單側急性損傷的模型，不能準確模擬臨床PDD患者的病理和癥狀。

2.3 PD轉基因模型

轉基因模型主要是基于家族性PD相關基因的發(fā)現(xiàn)，目前已經(jīng)鑒定16個致病基因, PD轉基因動物模型基于以上基因。常用的a-synuclien過表達的PD模型小鼠未觀察到抑郁樣行為學改變。一項研究發(fā)現(xiàn)，一種Parkin基因外顯子缺失的PD轉基因小鼠行為學實驗中未發(fā)現(xiàn)抑郁樣行為。Taylor等[21]發(fā)現(xiàn)VMAT2基因突變的PD轉基因老齡鼠(12～15月齡)在強迫游泳和懸尾實驗中表現(xiàn)為不動時間顯著增加的癥狀，而年輕VMAT2基因突變小鼠(4～6月齡)中未發(fā)現(xiàn)任何抑郁樣行為學改變。

3 PDD動物模型的評價的方法

3.1 行為學評價

3.1.1 糖水偏愛實驗: 糖水偏愛實驗能反映動物是否存在快感缺失。糖水偏愛度為蔗糖水消耗量占水消耗量與蔗糖水消耗量之和的比值，本實驗主要檢測PDD動物快感缺失的癥狀。

3.1.2 曠場實驗: 曠場實驗是評價實驗動物在新異環(huán)境中自主行為、探究行為的方法。檢測指標包括動物總探索距離、穿越箱子底面方格的數(shù)量和雙前肢抬起的次數(shù)。本實驗方法主要用于檢測PDD動物運動減少的抑郁癥狀和運動功能。

3.1.3 Morris水迷宮實驗: 該實驗能檢測動物的空間學習能力和再認知能力，主要方法包括定位航行試驗與空間探索試驗。本方法主要檢測PDD動物的記憶和學習能力。

3.1.4 懸尾實驗: 行為絕望是抑郁樣行為的表現(xiàn)之一，懸尾實驗通過使動物無法克服不正常體位的手段誘導產(chǎn)生行為絕望。

3.2 分子影像學技術

影像學技術的飛速發(fā)展為評價抑郁動物模型提供了更直觀、準確的生物學指標，如海馬體積、腦內(nèi)糖代謝水平等。

3.2.1 磁共振成像技術: 高強場磁共振技術在神經(jīng)結構方面有著良好的顯示能力。包和華等[22]發(fā)現(xiàn)，用磁共振成像技術測得抑郁癥大鼠雙側海馬體積顯著小于對照組，與傳統(tǒng)檢測手段(如糖水消耗實驗)的結果相比具有更顯著的相關性。朱彥等[23]利用磁共振質子波譜技術測定抑郁大鼠模型海馬區(qū)代謝情況，發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠模型左側海馬區(qū)Glx/Gr、NAA/Cr值對比正常組顯著下降，且與腦脊液內(nèi)IL-2、IL-6水平呈顯著負相關。

3.2.2 正電子發(fā)射體層成像技術: PET-CT中發(fā)展出一種專門檢測小型嚙齒動物腦內(nèi)代謝的影像學技術，即小動物PET(micro-PET)。氟[18F]標記的脫氧葡萄糖-小動物PET腦功能成像(18FDG-micro-PET)能通過腦內(nèi)葡萄糖代謝間接反映其功能代謝的變化。朱長強等[24]采用18FDG-micro-PET技術研究大鼠腦內(nèi)的葡萄糖代謝，發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠模型丘腦、海馬、紋狀體內(nèi)葡萄糖代謝水平顯著下降。

3.2.3 光遺傳學: 光遺傳技術是通過基因工程的手段，將光感基因轉入神經(jīng)元中進行離子通道的表達。離子通道在不同波長和頻率的光照刺激下選擇性允許某些陽離子或陰離子通過，使細胞膜兩邊的電位發(fā)生改變，從而選擇性地興奮或抑制神經(jīng)元。利用光遺傳學可以幫助揭示參與PDD發(fā)生、發(fā)展的神經(jīng)環(huán)路，如刺激中腦腹側被蓋區(qū)中的多巴胺能神經(jīng)元后，小鼠的抑郁相關行為改善，證明該腦區(qū)的神經(jīng)元與抑郁發(fā)病相關。光遺傳技術的出現(xiàn)大大優(yōu)化了動物行為學的實驗設計[25], 如高架迷宮實驗配合光遺傳學操控也可進行自身對照試驗(有光或無光)，極大的縮短了實驗周期和動物用量。由于光遺傳技術具有時間精確性，使得動物行為學實驗中研究關鍵時間窗腦區(qū)功能成為可能。例如，實驗動物在T迷宮里做出左右方向選擇的時間點。因成本低、周期短等特點，光遺傳技術在嚙齒類動物模型中應用廣泛。光遺傳技術為今后PDD方面的研究提供了更敏感精確的研究方法。

3.3 腦透明技術

Clarity 技術最早于2013年在Nature上報道。它是一種全新的腦組織形態(tài)學分析技術，該技術能保證大腦中每一個神經(jīng)元、蛋白質、脫氧核糖核酸鏈以及化學信號物質都被鎖定在原來的位置，因此能輕松地檢測出被標記分子，從而顯現(xiàn)出原有組織細胞形態(tài)的三維立體圖像[26]。Clarity技術應用于PDD的研究有利于追蹤發(fā)病過程中不同腦區(qū)神經(jīng)遞質表達變化的情況，探討參與PDD發(fā)病的神經(jīng)環(huán)路機制，篩選在PDD發(fā)生、發(fā)展中起重要作用的關鍵蛋白。另外, Clarity技術與功能磁共振成像技術相結合可揭示PDD發(fā)生發(fā)展過程中神經(jīng)網(wǎng)絡連接的變化。

4 小 結

抑郁在PD患者中發(fā)病較高，可能是神經(jīng)遞質異常、神經(jīng)炎癥、心理社會因素等多種元素相互作用的結果。要徹底揭開PDD發(fā)生發(fā)展的過程及機制，必須建立模擬人類PDD病程及演變規(guī)律的動物模型。目前建立的PDD動物模型不僅數(shù)量少，且實驗動物模型與PDD患者之間存在巨大的差異。理想的PDD動物模型要具有以下特征: ① 可檢測到PD的運動功能缺陷及隨時間進展的演變規(guī)律; ② 可檢測到顯著的抑郁癥狀; ③ 能模擬臨床PDD的病理生理學進展過程; ④ 能模擬PDD患者腦內(nèi)的神經(jīng)遞質變化規(guī)律。