王繼鋒 段莉 李耀璽 王大平

[關(guān)鍵字]外泌體；骨性關(guān)節(jié)炎；間充質(zhì)干細胞

隨著人口的老齡化，骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）已經(jīng)成為致殘的重要原因之一，且發(fā)病率逐年上升，被稱為不治之癥。OA 的發(fā)病機制十分復雜，正常人的關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，軟骨細胞占關(guān)節(jié)軟骨體積的1%～5%，其可分泌Ⅱ型膠原、透明質(zhì)酸等成分，維持細胞外基質(zhì)的代謝平衡。當年齡增大時，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性纖維病變，彈性降低，生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，軟骨細胞發(fā)生過度增殖及肥大化，最終導致不能正常合成聚氨基葡萄糖及透明質(zhì)酸，從而導致軟骨降解及基質(zhì)的丟失[1]。外泌體是一種由細胞分泌的微囊泡，其在人體中的細胞或系統(tǒng)之間的交流、調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及對一些疾病的影響起到重要作用。最新研究表明，不同細胞來源的的外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到十分重要的作用。本文就外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎治療的研究進展做一綜述。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的概念

外泌體（exosome，EXOs）是一種由細胞分泌的，直徑為30～150 nm 的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的膜性扁平杯碟狀的微囊小泡，其包含核酸、蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)。最初人們認為這些囊泡狀物質(zhì)是細胞排泄的廢物，但隨著科學研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)這些微囊泡在生物體細胞及系統(tǒng)間的通迅交流中起到極其重要的作用[2]。與傳統(tǒng)信息信號途徑相比，EXOs 是一種細胞之間更高等級的交流方式，其作為載體可將miRNA、mRNA 及蛋白質(zhì)等多種大分子或小分子運送到靶細胞中，從而參與人體細胞或系統(tǒng)間的調(diào)控作用[3]。

1.2 外泌體的分離

EXOs 是通過多泡體與質(zhì)膜或漿膜融合形成的，直徑為30～150 nm，而微囊泡的形成則是從質(zhì)膜上脫落，直徑為100～1 000nm。2009 年，布魯諾等將MSC 的分泌物對甘油所致的急性腎損傷的改善作用歸因于微囊泡（80 nm 到1 m之間）的作用。而相比較之下，Lai 等[4]認為這是外泌體起到了保護的作用。這是一種內(nèi)源性的囊泡，并具有外源性的相關(guān)蛋白，如Alix、TGS101 及CD9、CD63 和CD81 等。由于研究EXOs的功能結(jié)構(gòu)需要排除病毒或其他雜質(zhì)蛋白的影響，故如何能最大化地除去雜質(zhì)來保證分離出外泌體的純度成為關(guān)鍵。而不同的EXOs 提取方法所獲得EXOs 無論從純度還是從粒子的完整性方面差異均較大。目前，EXOs 的提純分離方法主要分為以下幾種:蔗糖密度梯度離心法;差速超速離心法;化學沉淀法;凝膠過濾法;免疫親和法。Labb 等[5]認為，使用化學沉淀法來提取EXOs 雖然可以獲得大量顆粒，但純度不夠，即所得產(chǎn)物中雖然有大量蛋白質(zhì)，但都不屬于EXOs。而超速離心法可以很好地達到純度要求，但由于轉(zhuǎn)速過快導致易破壞EXOs 表面囊泡狀膜結(jié)構(gòu)。此外一些研究表明，可利用免疫親和法來獲取EXOs?？贵w通過共價鍵或高親和力與磁珠相互作用，通過低速離心或磁性技術(shù)來進行物理分離。Sharma 等[6]開發(fā)出了一種新的基于免疫親和的方法來從患者血漿中的正常細胞分泌的EXOs 中分離黑色素瘤細胞分泌的EXOs（MTEX）。

1.3 外泌體的鑒定

2 外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎中的應用研究進展

2.1 外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎診斷中的研究進展

炎癥是OA 滑膜炎導致骨和軟骨破壞的進展過程的關(guān)鍵因素之一。炎癥過程所產(chǎn)生的一系列促炎細胞因子、趨化因子及一些基因的表達在OA 的發(fā)病機制中起到了特殊作用[8]。Domenis 等的研究表明，滑膜液（synovial fluid,SF）來源的外泌體可以刺激外周血單核細胞分化的炎性M1巨噬細胞分泌IL-1 和IL-16[9]，而IL-1 在OA 發(fā)病機制中的關(guān)鍵作用已被廣泛認識，IL-1 在OA 滑膜液中的水平顯著升高，這可使其在OA 診斷中起到生物標記物的作用[10]。而且，IL-1 在參與OA 發(fā)病機制中的細胞級聯(lián)反應中的上游發(fā)揮作用，其可誘導其他幾種促炎反應因子（如IL-6 和IL-8）的表達和釋放，以及基質(zhì)金屬蛋白酶的合成。在這項研究中，Domenis 等還發(fā)現(xiàn)SF 分泌的外泌體能刺激M1 型巨噬細胞產(chǎn)生CCL-20、CCL-15 和CXCL1 等趨化因子。CCL-20 能通過誘導相關(guān)分解基因的表達和改變軟骨細胞表型來發(fā)揮作用，其刺激MMP-13、ADAMTS-5 和COL-X 型mRNA 的表達，同時抑制新鮮的體外培養(yǎng)的軟骨組織中COLⅡ型mRNA 的表達[11]；而CXCL1 在OA 軟骨細胞中表達上調(diào)[10]，其可誘導軟骨細胞肥大和凋亡。SF 分泌的外泌體還能刺激M1 巨噬細胞釋放MMP7 和MMP12。這兩種蛋白酶據(jù)研究發(fā)現(xiàn)與OA 嚴重程度密切相關(guān)[12-13]。MMPs 是導致軟骨降解的主要酶，而軟骨細胞外基質(zhì)的降解是OA 的最本質(zhì)的特征。以上研究說明，外泌體作用于細胞后產(chǎn)生的相關(guān)細胞因子可以為診斷骨性關(guān)節(jié)炎提供一個新思路。

2.2 外泌體在治療骨性關(guān)節(jié)炎中的研究

目前，對于人胚胎干細胞誘導的間充質(zhì)干細胞（ESCMSCs）來源的EXOs 對骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用機制研究頗為深入。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn)，向C57 小鼠關(guān)節(jié)腔里注射ESCMSCs 可以減輕DMM 模型中的軟骨破壞和細胞外基質(zhì)的降解。這種作用最終被確定為是ESC-MSCs 分泌的EXOs 發(fā)揮的作用。在IL-1 的存在下，EXOs 通過增加Ⅱ型膠原的合成以及提高ADAMTS5 的表達來維持軟骨細胞的表型，即ESC-MSCs可以通過EXOs來平衡軟骨細胞外基質(zhì)的合成和降解，達到治療OA 的作用，這為OA 的防治以及藥物開發(fā)提供了一個嶄新的思路。有體外實驗證明，在具有免疫活性的大鼠軟骨缺損模型中，人間充質(zhì)干細胞分泌的EXOs 可促進其軟骨再生[15]。結(jié)果 顯示，MSCs-EXOs 可加速軟骨組織的填充以及增強了Ⅱ型膠原蛋白和硫酸糖胺聚糖等基質(zhì)的合成。EXOs 處理過的大鼠軟骨和軟骨下骨完全修復，表面規(guī)則，具有透明軟骨的特征。這種透明軟骨可以與周圍的正常軟骨相緊密結(jié)合，渾然一體，并觀察到有大量的細胞外基質(zhì)沉積。

2.3 外泌體與骨性關(guān)節(jié)炎的微環(huán)境

有研究表明，低氧是骨性關(guān)節(jié)炎形成的一個重要因素。其中，低氧誘導因子1（HIF-1 ）通過激活低氧反應元件被認為是細胞適應低氧和分解應激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[16]。通過誘導相關(guān)合成因子和抑制一些關(guān)鍵的分解因子來維持和調(diào)節(jié)軟骨紊態(tài)。例如，HIF-1 可促進COX-2、CXCL-2 及IL-1、IL-6 的合成，從而引發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境中的炎癥反應，HIF-1 通過NF-/HIF-1 信號通路上調(diào)MMP2 和MMP9 的表達。這也說明關(guān)節(jié)液和軟骨組織中的HIF-1 在OA 的發(fā)病機制中起到了重要作用。有研究表明，在TNF-誘導的軟骨細胞凋亡中，HIF-1 修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞來源的外泌體（BMSC-EXOs）對關(guān)節(jié)軟骨損傷具有修復作用，其可抑制炎癥環(huán)境中軟骨細胞的凋亡[17]。

上述骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境的變化也與軟骨細胞分泌的EXOs 載有的一些蛋白質(zhì)和微小RNA 有關(guān)[18]。MiRNA 是一種單鏈的非編碼的小分子，長度為20 個核苷酸左右，其可影響OA 的炎癥反應過程，MSCs-EXOs 中含有大量的miRNA，這在MSCs-EXOs 治療外泌體中發(fā)揮著重要作用，如miR-92a 可通過增強軟骨細胞增殖、誘導軟骨形成而達到治療OA 的目的[19]。MiR-320 則可以增加軟骨細胞ECM 合成并下調(diào)負性調(diào)節(jié)因子（如MMP-13 和ADAMTS-4）的表達來減輕OA 的發(fā)生[20]。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146 加重了促炎癥細胞因子的表達，同時抑制了軟骨基質(zhì)相關(guān)基因的表達，其通過下調(diào)TNF-/ 途徑來參與OA 進程。動物實驗證明，用miR-146 抑制劑治療的經(jīng)手術(shù)誘導的OA小鼠，通過靶向Camk2d和Ppp3r2顯著減輕了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。有研究表明，由軟骨細胞分泌的外泌體中所表達的Wnt5a 和Wnt5b 通過選擇性的Wnt 信號通路激活了Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP），增強了軟骨細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，但卻降低了軟骨細胞ECM的分泌。實驗證實，SMSC-140-EXOs 增強了ACs 的增殖和遷移，卻沒有降低ECM 的體外分泌的缺點。體內(nèi)實驗進一步證實，SMSC-140-EXOs 可以成功阻止大鼠OA 模型疾病的發(fā)生[21]。這些miRNA 既存在于EXOs 中，同時也參與了MSCs 抑制OA 的炎癥反應。這是促進關(guān)節(jié)軟骨修復改善OA的潛在策略[22]。

2.4 不同細胞來源的外泌體對骨性關(guān)節(jié)炎的影響

關(guān)節(jié)滑膜炎癥和血管生成是OA 發(fā)病的重要因素。有實驗表明，用在IL-1 刺激下的人滑膜成纖維細胞（synovial fibroblasts，SFB）分泌的外泌體可以誘導軟骨細胞OA 樣基因表達模式的改變和軟骨降解[23]。與沒有被IL-1 刺激的SFB 相比，使用IL-1 刺激SFB 后分泌出的外泌體可以使軟骨細胞中的MMP-13 和ADAMTS5 的表達顯著上調(diào)，并且下調(diào)了COL2A1 和ACAN。Nanostring 分析表明，IL-1 刺激下的SFB 與未刺激的SFB 分泌的外泌體中有50 種miRNAs 的表達水平存在差異。這說明SFB 可能通過刺激關(guān)節(jié)軟骨的基因表達來促進血管生成，從而參與血管生成。

Gasado 等研究發(fā)現(xiàn)，利用來源于骨髓間充質(zhì)干細胞的外泌體（BMSC-EXOs）作用于豬的抗炎滑膜炎模型，發(fā)現(xiàn)其最終可以使動物模型中滑膜淋巴細胞減少，抑制T 細胞分泌TNF-。動物模型上的的動力學步態(tài)分析，如擺動時間、步長時間和姿態(tài)持續(xù)時間等參數(shù)也較之前有所改變，說明了BMSC-EXOs 在疾病中起到了免疫調(diào)節(jié)的作用[24]。

另有研究比較了誘導的多能干細胞來源的間充質(zhì)干細胞（induced pluripotent stem cell-derived MSCs，iMSC）和SMMSCs 兩種細胞來源的EXOs 對OA 的治療作用效果，實驗表明，注射iMSC-EXOs 和SMMSC-EXOs 都能減輕小鼠OA 模型的疾病發(fā)生，但iMSC-EXOs 的治療效果要優(yōu)于SMMSC-EXOs[25]。Gibson 等[26]證明了BMP-2 和Wnt-5a預處理的ESC 來源的EXOs 能促進大鼠軟骨缺損的修復。Wang 等也進行了類似的實驗，他們發(fā)現(xiàn)向關(guān)節(jié)內(nèi)注射ESCMSCs 可減輕DMM 模型軟骨破壞和基質(zhì)降解。進一步的體外研究表明，這種作用是通過ESC-MSCs 分泌的EXOs 發(fā)揮作用的。EXOs 通過增加Ⅱ型膠原合成和降低ADAMTS5的表達來維持軟骨細胞表型[14]。

SMMSCs 來源于滑膜，具有較高的自我更新能力，因為滑膜和關(guān)節(jié)軟骨在滑膜關(guān)節(jié)發(fā)育過程中由共同的細胞群發(fā)育而來，因此SMMSCs 比其他MSCs 與軟骨細胞的關(guān)系更加密切。研究顯示，SMMSCs 比BMSCs 和AMSCs 更適合用于軟骨修復，體外實驗表明，SMMSC-EXOs 能顯著促進軟骨細胞的遷移和增殖[25]。但其也有缺點，在小鼠OA 模型中，SMMSC-EXOs 處理過后的軟骨表面不平整，蛋白多糖丟失，淺表區(qū)的軟骨消失，而用iMSC-EXOs 處理軟骨時未發(fā)現(xiàn)上述情況。更重要的一點是，iMSCs 的獲取途徑可由非侵入性方法獲取，而滑膜SMMSCs 的獲取過程需要進行創(chuàng)傷性的手術(shù)。移植患者特定的iMSC-EXOs 可以避免一些倫理方面的問題和免疫抑制相關(guān)的潛在問題，并且來源廣泛，取之不盡，可以滿足臨床需要。

3 小結(jié)與展望

目前，對于治療OA 的EXOs 療法還處于臨床實驗階段，MSC 還沒有被正式批準用于OA。但有600 多項研究已經(jīng)證實使用MSC 來治療OA 是安全的，而對MSCs-EXOs的深入研究勢必會改變現(xiàn)有的OA 的細胞療法，解決許多與使用活細胞作為治療藥物的有關(guān)難題，如免疫排斥反應，因為EXOs 具有最小的免疫原性和毒性[27]。而且，使用EXOs藥物治療這種方式更易被人們所接受。因為這種細胞外囊泡是人本身身體生理所具有的，它們可以通過一些非侵入性的途徑，比如口服攝入、鼻腔黏膜給藥，甚至可以吸入給藥。EXOs 藥物更適合商品化，我們可以通過基因操作來選擇外泌體的來源細胞，從而生產(chǎn)具有無限繁殖潛力的克隆細胞系，來確保可再生的成本效益[28]。然而，在軟骨修復這個方面，利用EXOs 治療OA 仍有一些問題亟待解決，如向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射EXOs 后對關(guān)節(jié)腔內(nèi)EXOs 的分布情況和清除速率如何進行準確的評估目前尚未研究透徹，但不管怎樣，EXOs 未來在治療OA 的地位肯定會呈指數(shù)般上升。