柯 璐 戴曉麗 徐 珊 黃嫦嬌 林 杰

（1.福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心 福建福州 350003；2.福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

1 前言

生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中特殊的一類，在提高實(shí)驗(yàn)室的測試水平和科研能力上有重要作用，是檢測技術(shù)高效、準(zhǔn)確運(yùn)行的重要前提和保障[1]。含基質(zhì)的生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究已成為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的重點(diǎn)，我國在含食品基質(zhì)的食源性致病菌標(biāo)準(zhǔn)品領(lǐng)域仍處于起步階段[2]。大腸埃希氏菌O157∶H7/NM（Escherichia Coli O157∶H7/NM）是腸出血性大腸埃希氏菌的主要病原血清型。雞肉、牛肉、生奶及其制品，蔬菜、水果及其制品等均可能受其污染，受污染的食物在外觀與氣味上不明顯，但是仍可使人患病，嚴(yán)重者甚至?xí)鹚劳鯷3，4]。因此，研制添加基質(zhì)的大腸埃希氏菌O157∶H7/NM定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有重要意義。本文以大腸埃希氏菌O157∶H7/NM為目標(biāo)菌，添加雞肉粉，配合保護(hù)劑通過冷凍干燥法制備含一定菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性驗(yàn)證，為今后開展含基質(zhì)的微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究提供一定參考作用。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

2.1.1 菌源

大腸埃希氏菌O157:H7/NM（E.coli O157:H7/NM，以下簡稱“O157”）（上海漢尼公司），ATCC 43895。

2.1.2 基質(zhì)

雞胸脯肉（市場）低溫運(yùn)輸，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 試劑（表 1、表 2）

表1 保護(hù)劑

表2 培養(yǎng)基及其他試劑

2.1.4 其他

一次性針頭過濾器（33 mm，0.22 μm）（廣州賽國生物科技有限責(zé)任公司）；一次性使用無菌注射器（江蘇康友醫(yī)用器械有限公司）；5 mL西林瓶（配套丁基膠塞）（安徽華欣藥用玻璃制品有限公司）；篩網(wǎng)：50目標(biāo)準(zhǔn)篩。

2.2 儀器與設(shè)備

主要儀器與設(shè)備詳見表3。

表3 主要儀器與設(shè)備

2.3 方法

2.3.1 基質(zhì)前處理方法

雞肉剔除脂肪及碎骨等非肉組織，切成小肉丁，鋪開置于拖盤上，于-70℃預(yù)凍20 h后置于真空干燥機(jī)中，-40℃下冷凍干燥45 h，10℃下冷凍干燥8 h。用搗碎機(jī)粉碎，分批過50目篩，充分混勻雞粉。按照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[5]對其進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，分裝于無菌自封袋中，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果選擇60Co輻射劑量為6 kg，輻照后無菌，室溫下保存干燥鍋中，在每次使用前進(jìn)行一次菌落計(jì)數(shù)，保證基質(zhì)無污染。

2.3.2 菌種復(fù)活

凍干菌株恢復(fù)至室溫，用腦心浸液（BHI）肉湯溶解，吸取適量接種于BHI肉湯，（36±1）℃培養(yǎng) 18～24 h。新鮮菌液按1∶1與50%的甘油混合后，分裝于1.5 mL無菌離心管中，保存于-20℃，待用（甘油保存菌液含菌量107CFU/支）。

2.3.3 相關(guān)曲線方程

菌齡一般分為4個(gè)階段：適應(yīng)期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。穩(wěn)定期時(shí)菌液營養(yǎng)物質(zhì)剛好維持存活，處于穩(wěn)定期的細(xì)胞或成熟的孢子對不良環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，因此，不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌，應(yīng)采用對數(shù)生長末期或穩(wěn)定期初期的細(xì)胞作為凍干干燥的菌齡。

吸取甘油保存液1 mL于9 mL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中，作10倍數(shù)稀釋，直至10-5。吸取10-5稀釋液0.1mL于50mL EC肉湯中（平行3瓶），振蕩均勻后，于（36±1）℃靜置培養(yǎng)。定時(shí)取出，同時(shí)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及吸光度（OD）值檢測。繪制菌落對數(shù)值—OD值的關(guān)系曲線，菌落對數(shù)值—時(shí)間的關(guān)系曲線。

2.3.4 預(yù)凍及冷凍干燥參數(shù)設(shè)計(jì)

細(xì)菌對不同的降溫速率有著不同的敏感程度，細(xì)菌細(xì)胞表面積/體積的數(shù)值大小決定了對水分的滲透率，而細(xì)胞對水分的滲透率受到凍結(jié)速度的影響[6]。當(dāng)采用慢速冷凍時(shí)，由于細(xì)胞外溶液濃度低，結(jié)晶首先在細(xì)胞外發(fā)生，而此時(shí)細(xì)胞內(nèi)水分還以液態(tài)存在，較大的冰晶易對細(xì)胞組織造成機(jī)械損傷，影響產(chǎn)品的品質(zhì)。此外，冷凍濃縮效應(yīng)使細(xì)胞質(zhì)中鹽濃度升高和pH變化，造成蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致細(xì)胞失活。而當(dāng)采用快速冷凍時(shí)，物料組織內(nèi)冰層推進(jìn)速度大于水移動(dòng)的速度，冰晶分布接近食品中液態(tài)水的分布狀態(tài)，且冰晶體積小，對產(chǎn)品的質(zhì)量有利[7，8]。添加雞肉基質(zhì)的樣品，濃稠度大，基質(zhì)的蓄水型強(qiáng)，因此，干燥時(shí)需另調(diào)整溫度和時(shí)間。-70℃預(yù)凍時(shí)間均為20 h。參數(shù)設(shè)計(jì)詳見表4和表5。

表4 無基質(zhì)樣品冷凍干燥參數(shù)設(shè)計(jì)

表5 含基質(zhì)樣品冷凍干燥參數(shù)設(shè)計(jì)

2.3.5 保護(hù)劑的選擇

保護(hù)劑需要在凍干和保存的過程中發(fā)揮賦形劑和營養(yǎng)液的作用，營養(yǎng)液可修復(fù)受凍干影響而損傷的細(xì)胞；賦形劑主要起骨架作用，使凍干物形成多孔疏松的海綿狀結(jié)構(gòu)，從而增加溶解度。因此，在組合配方時(shí)就必須考慮到這兩大作用[9]。本文選擇脫脂牛奶、D-海藻糖、蔗糖作為基礎(chǔ)配方，再輔以填充劑（PVP），pH穩(wěn)定劑（甘氨酸）進(jìn)行保護(hù)劑選擇試驗(yàn)。

（1）添加菌液的制備。吸取甘油保存液1 mL于9 mL PBS中，作10倍數(shù)稀釋至10-5。吸取10-5稀釋液0.1 mL于50 mL EC肉湯中，根據(jù)2.3.3的曲線方程預(yù)估培養(yǎng)時(shí)間，檢測菌液OD值，以此獲得生長至穩(wěn)定初期的菌液并估算其含菌數(shù)。預(yù)定凍干前樣品含菌量為103CFU/mL，根據(jù)保護(hù)劑配制總體積為50mL及預(yù)估菌數(shù)推算新鮮培養(yǎng)菌液的稀釋度。

（2）細(xì)菌存活率的計(jì)算。凍干前對樣本進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果記為M。從冰箱中取出凍干樣本恢復(fù)至室溫后，吸取2.5 mL BHI復(fù)水，用1 mL平頭移液管吹吸均勻后分別吸取1 mL制備2片計(jì)數(shù)平皿，結(jié)果記為N。細(xì)菌存活率（即保護(hù)劑保護(hù)率）記為S。計(jì)算詳見式（1）。

冷凍干燥后7 d內(nèi)凍干樣本菌濃度下降快（保存7 d后的菌落數(shù)記為P），因此選擇保護(hù)劑時(shí)可以以凍干后7 d下降率作為參考條件。下降率記為C，計(jì)算詳見式（2）。

（3）保護(hù)劑添加水平及配方設(shè)計(jì)。對T，S和M先進(jìn)行單因素添加水平的試驗(yàn)。添加水平詳見表6，用無菌水配制T、S、M的單劑保護(hù)劑體積100 mL，115℃下高壓滅菌30 min，冷卻后分別添加細(xì)菌稀釋液1 mL（統(tǒng)稱混合液A），使混合液A的含菌數(shù)為103CFU/mL。置于搖床振蕩器上勻速振搖10 min后，上下顛倒充分混合，吸取1 mL于無菌平皿進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，作6個(gè)平行，每次吸取前需重新上下顛倒，取平均值作為混合液A的菌濃度。按3 mL分裝于5 mL西林瓶中，-70℃下預(yù)凍20 h后冷凍干燥，按照2.3.4冷凍干燥參數(shù)表4進(jìn)行凍干。于凍干后第0 d檢測凍干樣品的菌濃度，取12個(gè)平行樣本，每個(gè)樣本用3mL無菌BHI復(fù)水（室溫下靜置5min），吹吸混勻后立即檢測，取1 mL于平皿，平行2個(gè)，另取1 mL于9 mL PBS中進(jìn)行10倍數(shù)稀釋，對每個(gè)稀釋度進(jìn)行平行2次計(jì)數(shù)取平均值。按照式（1）和式（2）計(jì)算3種單劑在凍干后的存活率（取平行6個(gè)的計(jì)數(shù)結(jié)果均值）。

表6 單因素水平設(shè)計(jì)

在基礎(chǔ)配方I中添加不同水平的填充劑PVP和pH穩(wěn)定劑甘氨酸，詳見表7?；旌暇鶆蚝?15℃高壓滅菌30 min。冷卻后添加細(xì)菌稀釋液1 mL（記為混合液B），使混合液B的含菌數(shù)為103CFU/mL。凍干前計(jì)數(shù)后分裝，按照單因素保護(hù)劑試驗(yàn)的流程進(jìn)行，每組12個(gè)平行。

2.3.6 基質(zhì)與基礎(chǔ)配方II混合比例設(shè)計(jì)

基質(zhì)的凍干脫水率約為75%，因此，1 g的基質(zhì)需至少3 mL的水復(fù)溶，將基質(zhì)與水的混合記為基質(zhì)液，當(dāng)按最低體積比配制時(shí)，基質(zhì)液濃稠，難以均勻混合，需提高基質(zhì)與水的體積比例至1∶5?；|(zhì)液與基礎(chǔ)配方II保護(hù)液混合后記為混合液C，添加新鮮菌液1 mL，使其含菌數(shù)為103CFU/mL。每組混合液吸取3 mL于西林瓶中，-70℃預(yù)凍20 h，按照表5參數(shù)進(jìn)行凍干?；旌媳壤斠姳?。

表7 PVP和甘氨酸添加水平設(shè)計(jì)

表8 基質(zhì)與基礎(chǔ)配方II混合比例設(shè)計(jì)

2.3.7 分批次制備凍干樣品

按照最優(yōu)的保護(hù)劑配方II：10%T+25%M+4%PVP+0.8%G，配制保護(hù)劑液。按照基質(zhì)與水的混合比例為1∶7，基質(zhì)液與保護(hù)劑液的混合比例為1∶3進(jìn)行配制。培養(yǎng)新鮮菌液（菌濃度約為2.6×108CFU/mL），稀釋后添加至混液C中，使得菌液濃度為2.6×103CFU/mL。按3 mL/瓶分裝，蓋以丁基膠塞，在-70℃下預(yù)凍，按照表5的凍干程序進(jìn)行凍干。相同方式制備6個(gè)批次的樣品。

2.3.8 均勻性驗(yàn)證

根據(jù)保護(hù)劑保護(hù)率約為40%，預(yù)估凍干后樣品的含菌濃度為1.0×103CFU/mL，對凍干后樣品進(jìn)行合適的稀釋計(jì)數(shù)。同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測，6個(gè)批次，每批次抽取10個(gè)樣品。計(jì)算統(tǒng)計(jì)量F，根據(jù)自由度及給定的顯著性水平 α=0.05，查得 Fα，當(dāng) F＜Fα?xí)r，組內(nèi)和組間無顯著性差異，即樣品均勻[10]。

2.3.9 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的不確定度評估結(jié)果

取不同批次的凍干樣品10份，每份樣品平行測量2次。合并樣本樣品標(biāo)準(zhǔn)差SP計(jì)算詳見式（3）。

其中，m—檢測的樣本數(shù)（m=10）；n—每個(gè)樣品重復(fù)檢測的次數(shù)（n=2）。

取置信水平95%，f（自由度）=10，經(jīng)過查t分布表得：t0.05（10）=2.228，則擴(kuò)展不確定度：

2.3.10 穩(wěn)定性驗(yàn)證

（1）短期穩(wěn)定性驗(yàn)證。設(shè)計(jì)存儲(chǔ)溫度為：-20℃、4℃、25℃，保存時(shí)間分別設(shè)計(jì)為 3 d、7 d、10 d、15 d、28 d，按設(shè)計(jì)的保存時(shí)間分別取3瓶凍干樣品驗(yàn)證，取平均值作統(tǒng)計(jì)分析。

（2）長期穩(wěn)定性驗(yàn)證。設(shè)計(jì)存儲(chǔ)溫度為：在短期穩(wěn)定性試驗(yàn)中，棄去不穩(wěn)定的保存溫度，在其他溫度下繼續(xù)追蹤長期穩(wěn)定性。保存時(shí)間分別設(shè)計(jì)為1 min、3 min、6 min、12 min、18 min。 按設(shè)計(jì)的保存時(shí)間分別取3瓶凍干樣品驗(yàn)證，取平均值做統(tǒng)計(jì)分析。

（3）計(jì)算公式及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。以x代表時(shí)間，y代表凍干樣品的菌濃度，擬合成一條直線，-20℃、4℃、25℃斜率分別記為 b1、b2、b3。

斜率計(jì)算：

截距bn：

直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差s2：

自由度：f-2=3

斜率的不確定度 s（bn），由式（8）計(jì)算：

若滿足|bn|＜t0.95，f-2×s（bn），則斜率是不顯著的，樣品未觀測到不穩(wěn)定性[12]。

3 結(jié)果與分析

3.1 相關(guān)曲線方程

在培養(yǎng)不同的時(shí)間間隔取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)及OD600值檢測。結(jié)果詳見表9。

以O(shè)D600值為主縱坐標(biāo)，以菌落計(jì)數(shù)值的對數(shù)值為次縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制OD600—菌落對數(shù)值相關(guān)曲線，即生長曲線。詳見圖1。

由表9和圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)至7.5～16 h時(shí)，細(xì)菌的生長開始進(jìn)入穩(wěn)定期，對數(shù)值曲線趨平，但活菌數(shù)仍在增加，OD600值仍有上升趨勢，16 h后固定體積增菌液中營養(yǎng)已基本消耗，增菌液的細(xì)菌濃度開始飽和，OD600值曲線趨平。選擇作為試驗(yàn)用的菌液，應(yīng)處于菌落對數(shù)值曲線進(jìn)入平向的初期以及OD600值仍為上升趨勢的階段，即培養(yǎng)至7.5～16 h的菌液。為方便預(yù)估菌落數(shù)，在7.5～16 h階段制作OD600菌落對數(shù)值相關(guān)曲線，詳見圖2，并生成方程：y=0.996 4x+8.157。

表9 不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)基的菌落計(jì)數(shù)log10值及OD600值

圖1 生長曲線

圖2 OD600菌落對數(shù)值相關(guān)曲線

3.2 保護(hù)劑的選擇

（1）對混合液A進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取平行3次結(jié)果的均值為3.6×103CFU/mL，結(jié)果詳見圖3。

圖3 3種保護(hù)劑不同添加水平的保護(hù)率

由圖3可知，T4保護(hù)率最高：24.72%；S4保護(hù)率最高：8.61%；M4保護(hù)率最高：18.33%。但蔗糖5個(gè)添加水平的保護(hù)率均低于海藻糖和脫脂奶，不將蔗糖作為保護(hù)劑組成成分，因此，10%T+25%M的組合記為基礎(chǔ)配方I。

（2）混合液B菌落計(jì)數(shù)取平行3次結(jié)果的均值為 1.5×103CFU/mL，結(jié)果詳見圖 4。

圖4 PVP和甘氨酸不同添加水平保護(hù)率

由圖4可知，試驗(yàn)序號4的保護(hù)率最高，為49.75%。甘氨酸的添加水平越大，保護(hù)劑pH越低，保護(hù)率越低，O157的最適pH范圍為5.0～8.0，因此，越接近中性值環(huán)境（弱酸性），存活率越大。選擇添加水平為0.8%；PVP添加4%時(shí)，保護(hù)率最高。即10%T+25%M+4%PVP+0.8%G為最優(yōu)基礎(chǔ)配方II。

3.3 基質(zhì)與基礎(chǔ)配方II混合比例

從冰箱中取出凍干樣品后，恢復(fù)至室溫，用3mL的PBS復(fù)水，靜置5 min后計(jì)數(shù)。分別吸取1 mL于2片無菌平皿中，另取1 mL于9 mL PBS中制成10-1的菌懸液，以此類推，稀釋至10-3。不同比例混合后的混合液C的保護(hù)率結(jié)果詳見表10。

由表10結(jié)果可知，試驗(yàn)9的菌落計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.03，相較于其他組合都低，且保護(hù)率為41.49%，因此，配比方式選擇試驗(yàn)9，即基質(zhì)與水的混合比例為1∶7，基質(zhì)液與保護(hù)劑液的混合比例為1∶3。

3.4 均勻性驗(yàn)證

同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測，6個(gè)批次記為：m1～m6，每批次抽取 10 個(gè)樣品，記為：n1～n10，檢測結(jié)果詳見表11，分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表12。

由表12可知，

該統(tǒng)計(jì)量是自由度（v1，v2）的F分布變量。根據(jù)自由度及給定的顯著性水平α=0.05，查得F=1.197＜Fα=2.201，則組內(nèi)和組間無顯著性差異，即樣品均勻。

表10 不同比例混合后的混合液C的保護(hù)率結(jié)果

表11 6批次樣品的菌落計(jì)數(shù)值

表12 分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.5 不確定度評估（表13）

由表13和式（3）計(jì)算合并樣本樣品標(biāo)準(zhǔn)差：Sp=51 CFU/mL?？傮w合成的樣本差Uc=36 CFU/mL。取置信水平 95%，f（自由度）=10，查 t分布表得：t0.05（10）=2.228，擴(kuò)展不確定度：U2=t×Uc=2.228×36=80.208 CFU/mL，取整數(shù)則U=80 CFU/mL。當(dāng)測量檢驗(yàn)結(jié)果用2次測量值平均值表示結(jié)果時(shí)，其值分布區(qū)間在±80CFU/mL之間。

表13 定值方法不確定度的計(jì)數(shù)結(jié)果

3.6 樣品的穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果

3.6.1 短期穩(wěn)定性檢測（表14、表15）

表14 短期穩(wěn)定性測量數(shù)據(jù)

由表15可得，保存28 d時(shí)，-20℃的溫度下|b1|＜t0.95，f-2×s（b1），斜率是不顯著的，樣品未觀測到不穩(wěn)定性；而 4℃及 25℃時(shí)：|bn|＞t0.95，f-2×s（bn），即樣品不穩(wěn)定。

3.6.2 長期穩(wěn)定性檢測

冷凍干燥后在4℃和25℃保存，樣品特性值不穩(wěn)定，因此，對-20℃進(jìn)行長期穩(wěn)定追蹤，并以第1個(gè)月起的檢測值作為統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，詳見表16。

表15 保存28 d數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

表16 -20℃下長期保持的穩(wěn)定性測量數(shù)據(jù)

|b1|=0.000 349 599，s（b1）=0.000 502 220 6，t0.95，f-2=3.182，則 t0.95，f-2×s（b1）=0.001 592 08。 則在-20℃的溫度下保存 18 個(gè)月時(shí)，|b1|＜t0.95，f-2×s（b1），斜率是不顯著的，即保存第1個(gè)月起至第18個(gè)月未觀測到不穩(wěn)定性。

4 討論

4.1 保護(hù)劑的選擇

單糖在凍結(jié)過程中只能提供非常微弱的穩(wěn)定作用，使得蛋白質(zhì)在脫水干燥前就發(fā)生不可逆變性。二糖既能在凍結(jié)過程中起到低溫保護(hù)劑的功能，又能在干燥脫水過程中起到脫水保護(hù)劑的作用[13]。因此，常采用低聚糖，尤其是二糖作為保護(hù)劑。還原性二糖以及非還原性二糖在冷凍干燥過程中都具有很好的保護(hù)效果，但在貯藏過程中，由于還原性二糖的存在會(huì)使得凍干品發(fā)生美拉德反應(yīng)，所以冷凍干燥配方中，蔗糖和海藻糖是最常用的2種保護(hù)劑。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）起著低溫保護(hù)劑和脫水保護(hù)劑的作用，又是很好的填充劑，還能抑制小分子賦形劑（如蔗糖）的結(jié)晶。凍結(jié)過程中，溶液的pH也會(huì)發(fā)生變化，因此，需要在冷凍干燥過程和貯藏過程中，添加能將pH調(diào)整到活性物質(zhì)的最穩(wěn)定區(qū)域的物質(zhì)（即pH穩(wěn)定劑），如甘氨酸。

4.2 不確定度評估

本次實(shí)驗(yàn)中使用的移液器的擴(kuò)展不確定度：U=0.1%（k=2）；電子天平擴(kuò)展不確定度U=2.793 4mg。在定值中移液器和電子天平的不確定度可忽略不計(jì)。僅對定值方法進(jìn)行不確定度評估。

4.3 不穩(wěn)定性追蹤

該標(biāo)物的基質(zhì)為肉類，且無經(jīng)過特殊處理，雞肉中含有一定的脂肪且具有肉類應(yīng)有的生物特性，真空干燥后仍有一定量的水分，容易受溫度的影響而變質(zhì)，因此，在4℃以及25℃下保存，其特性值不穩(wěn)定。