左惠芬 趙 菲 王軍花 谷敬欣 呂國平 吳淑慧*

（1.河北以嶺醫(yī)院檢驗科 河北石家莊 050091；2.河北工程大學生命科學與食品工程學院；3.河北中醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院)

1 前言

眾所周知，嗜麥芽窄食單胞菌是一種條件致病菌，同時也是導(dǎo)致人類高發(fā)病率、高死亡率的重要醫(yī)院感染病原菌，有嚴重基礎(chǔ)疾病、高齡、重癥、免疫力低下、長期使用廣譜抗菌藥物的患者易感，該菌除了對碳青酶烯類抗菌藥物天然耐藥外，對其他抗菌藥物耐藥性也極高，往往呈現(xiàn)多重耐藥性。近年來，嗜麥芽窄食單胞菌引發(fā)的感染備受關(guān)注，臨床上該菌的治療非常棘手[1]。而中藥抗感染治療有悠久的歷史，清熱解毒類中藥在抑菌方面表現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢和開發(fā)價值[2-6]?；谝陨媳尘?，本文用西青果、黃連、黃芩、板藍根、龍膽5種中藥對嗜麥芽窄食單胞菌的抑菌活性進行檢測，以期尋找對嗜麥芽窄食單胞菌有效的中藥，為有效控制該菌感染提供新方法。

2 材料與方法

2.1 菌株的選取

實驗菌株由河北以嶺醫(yī)院和河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院臨床患者的痰液、尿液、膿液、血液、腦脊液、腹水等標本進行分離收集，經(jīng)篩選，得到12株對復(fù)方新諾明等14種抗菌藥物全耐藥的嗜麥芽窄食單胞菌，經(jīng)API 20NE鑒定條進行鑒定。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853和嗜麥芽窄食單胞菌ATCC17666（康泰生物科技有限公司）。

2.2 試劑

Mueller-Hinton瓊脂（杭州天和微生物試劑有限公司）；API 20NE鑒定條（法國生物梅里埃公司）；哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明藥敏紙片（康泰生物科技有限公司）；西青果、黃連、黃芩、龍膽、板藍根（河北以嶺醫(yī)院藥房）。

2.3 試驗方法

2.3.1 中藥水煎液的制備

將所選5種中藥采用常規(guī)方法制成水煎液[7]，即100 g中藥制成200 mL 50%中藥水煎液。高壓蒸汽滅菌115℃ 30 min，4℃冷藏備用。

2.3.2 含藥Mueller-Hinton（MH）平板制備

將50%（1∶2）中藥水煎液用無菌蒸餾水倍比稀釋9個梯度，置于試管中，1～9號試管含藥液濃度依次為 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512，各10mL；10號管為10mL蒸餾水，作為無藥對照液。

稱取MH粉末38 g，加蒸餾水900 mL加熱溶解后，經(jīng)121℃ 15 min滅菌；采用無菌操作的方法，分裝10瓶，每瓶90 mL。

將上述倍比稀釋的中藥稀釋液及無藥對照液分別加入相應(yīng)MH培養(yǎng)基中，充分混勻后傾注于4個內(nèi)徑為90 mm的平皿內(nèi)，待凝固后備用。最終獲得的培養(yǎng)平皿藥液濃度分別為：1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、0， 備用。

2.3.3 含藥MH培養(yǎng)基的藥物濃度計算

將50%原藥材水煎液100 mL置于干燥箱中烘干，稱重，計算出1 mL水煎液的中藥干重及含藥培養(yǎng)基中的中藥干重，如每100 mL 50%西青果煎液干重為16 920mg，第1組每100mL含藥培養(yǎng)基中含煎液10 mL，則每毫升培養(yǎng)基含煎液干重為：

第1組含藥培養(yǎng)基的含煎液干重為16.920mg/mL，根據(jù)倍比稀釋法，從1∶20至1∶5 120各稀釋度的培養(yǎng)基內(nèi)藥物濃度分別為：16.920 mg/mL、8.460 mg/mL、4.230 mg/mL、2.115 mg/mL、1.058 mg/mL、0.529 mg/mL、0.265mg/mL、0.133mg/mL、0.067mg/mL。

2.3.4 中藥試驗相關(guān)指標測定

將嗜麥芽窄食單胞菌的新鮮菌落混懸于3 mL生理鹽水中，調(diào)整濃度至0.5麥氏單位，10倍稀釋后備用。用微量加樣器吸取1 μL菌液接種至備好的不同含藥平皿上，按含藥濃度從低到高的平皿順序接種，最終接種菌量為104CFU，35℃培養(yǎng)20～24 h后觀察，如果無藥平板上菌株全部生長，則記錄最低抑菌濃度（MIC），統(tǒng)計各中藥的MIC50（抑制50%細菌生長的最低藥物濃度）、MIC90（抑制90%細菌生長的最低藥物濃度）[8]。

2.3.5 紙片（KB）法藥敏實驗

參照相關(guān)標準，采用KB法做常規(guī)藥敏試驗，測量抑菌環(huán)直徑，其中左氧氟沙星和復(fù)方新諾明依據(jù)CLSI 2018版嗜麥芽窄食單胞菌的藥敏試驗標準判讀[9]，其余藥物因CLSI暫無針對嗜麥芽窄食單胞菌的標準，故頭孢噻肟、頭孢曲松參照不動桿菌屬，其余10種藥物參照銅綠假單胞菌的標準判讀，報告結(jié)果敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。

3 結(jié)果

（1）12株嗜麥芽窄食單胞菌對哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、替卡西林/棒酸、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明14種抗菌藥物全部耐藥。

（2）西青果等5種中藥在不同濃度下對嗜麥芽窄食單胞菌ATCC17666的抑菌情況詳見表1，其中西青果、黃連、黃芩的水煎液對標準菌株有不同程度的抑制作用，板藍根、龍膽的水煎液則無抑制作用。

（3）西青果等5種中藥對12株嗜麥芽窄食單胞菌抑菌活性情況詳見表2，檢測的5種中藥中西青果、黃連、黃芩的水煎液對嗜麥芽窄食單胞菌有不同程度的抑菌活性；板藍根、龍膽的水煎液在此次實驗中即使在最高的濃度下對嗜麥芽窄食單胞菌仍無抑菌活性。

（4）西青果、黃連、黃芩的水煎液對嗜麥芽窄食單胞菌質(zhì)控菌株和臨床菌株的MIC、MIC50、MIC90詳見表3，無論質(zhì)控菌株抑或臨床菌株，西青果抑菌活性最強，黃連、黃芩次之。

表1 嗜麥芽窄食單胞菌 ATCC17666在不同濃度中藥平板上的生長情況

表2 不同濃度中藥對12株嗜麥芽窄食單胞菌累積抑菌百分率

表3 中藥對12株嗜麥芽窄食單胞菌的抗菌活性

4 討論

近年來，嗜麥芽窄食單胞菌引發(fā)的感染有所增加，該菌對β-內(nèi)酰胺類、碳青霉烯類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類等多數(shù)抗菌藥物廣泛耐藥，其耐藥機制主要與抗菌藥物滅活酶、細菌外膜通透性降低、mqnrs基因以及整合子、多藥外排泵系統(tǒng)、生物被膜形成等相關(guān)[10]，可供臨床選擇的藥物有限，因此，人們應(yīng)該重視該菌引發(fā)的感染，一方面，根據(jù)藥敏報告結(jié)果合理選擇抗菌藥物；另一方面，采取適當?shù)脑簝?nèi)感染干預(yù)措施，減少該菌的播散，積極地尋找可替代藥物已刻不容緩。

中藥抗菌作用歷史悠久，中外研究者對此做了許多研究工作并取得了可喜的成果。中藥含有多種抗菌成分，可同時作用于細菌不同部位、生長階段與代謝環(huán)節(jié)乃至于人體的免疫系統(tǒng)。區(qū)別于已有抗菌藥物的單一成分的作用，具有獨特的優(yōu)勢。本文試驗中西青果、黃連、黃芩無論對嗜麥芽窄食單胞菌標準菌株和全耐藥的臨床菌株均有良好抑菌效果，尤其西青果最低抑菌濃度小，黃連、黃芩次之。

西青果，亦稱藏青果，是使君子科植物訶子的干燥幼果，在藏族，西青果被視為圣藥，具有解毒療傷、清熱生津等多種作用。西青果富含酚酸類化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用[11]。關(guān)于西青果體外抑菌活性的研究報道較少，林小靜等[12]報道西青果對銅綠假單胞菌質(zhì)控菌株和耐藥菌株均有較強的抑菌作用，在本次試驗中檢測到其抑制嗜麥芽窄食單胞菌質(zhì)控菌株和臨床菌株的效果最好。王奉悅等[13]報道西青果總鞣質(zhì)與沒食子酸乙酯對金黃色葡萄球菌的殺菌機制與改變細菌細胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)相關(guān)，而西青果對嗜麥芽窄食單胞菌的抑菌成分、機制尚待進一步研究。西青果作為抗菌藥物的開發(fā)，仍值得進一步關(guān)注。

本次試驗中黃連、黃芩對嗜麥芽窄食單胞菌的抑菌效果也較好。陳仁德等[14-16]研究證實黃連、黃芩對臨床常見病原菌、耐藥菌均有不同程度的抑制作用。黃連不僅對普通細菌有很好的抑菌作用。王麗等[17]報道黃連對申克孢子絲菌也有很好的抑菌作用。李奕錚等[18]報道黃連水煎劑不僅能抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，而且與苯唑西林鈉聯(lián)合可提高金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的腹膜炎療效。黃連能否與抗菌藥物聯(lián)合更好地治療由嗜麥芽窄食單胞菌引起的感染值得探索。黃芩的主要成分是黃酮類化合物，主要有黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等，其中黃芩的抗菌有效成分以黃芩苷為主。劉連等[19]報道黃芩苷和黃芩素對變形鏈球菌具有很好的拮抗生物膜效果。劉彥晶[20]等報道黃芩對NDM-1乙酸鈣不動桿菌有抑菌及質(zhì)粒消除作用，關(guān)于黃連、黃芩對于嗜麥芽窄食單胞菌的抑菌成分及作用機理有待進一步研究。