藍(lán)海斌，許蜂蜂，程遠(yuǎn)，桑勇勇，王華翔，孔雨薇，楊芳，蔡秋程，劉建勇，江藝（.蚌埠醫(yī)學(xué)院教學(xué)醫(yī)院聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院肝膽外科，福建 福州5005；.廈門(mén)大學(xué)附屬東方醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 5005 ；.福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 5005；.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院肝膽外科，福建 福州 5005）

肝缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury,IRI）是指因肝臟失去血液供應(yīng)，導(dǎo)致器官缺氧引起的一種病理生理過(guò)程，通常分為熱缺血損傷和冷缺血損傷。熱缺血損傷通常發(fā)生于供肝切除術(shù)中過(guò)長(zhǎng)時(shí)間阻斷血流供應(yīng)、休克、創(chuàng)傷及心衰等情況下肝血流量減少引起，冷缺血損傷發(fā)生于移植供肝冷保存［1-2］。供肝缺血時(shí)間、供肝手術(shù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)及術(shù)后的全身炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致移植肝功能不全、原發(fā)性移植肝無(wú)功能、急性腎損傷、腸道損傷［3］和急性呼吸窘迫綜合征［4］等的發(fā)生，極大地增加了圍術(shù)期患者的發(fā)病率和病死率［5］。隨著肝移植技術(shù)的成熟，等待和完成肝移植手術(shù)的人數(shù)正逐年上升，但I(xiàn)RI仍舊威脅著移植患者的生命。因此，為解決IRI帶來(lái)的問(wèn)題，在手術(shù)灌注方式上，人們進(jìn)行了多樣的嘗試，存在先開(kāi)放動(dòng)脈、先開(kāi)放門(mén)靜脈及先開(kāi)下腔靜脈等多種術(shù)式。肝臟保存方式也有了巨大的變化，從傳統(tǒng)的靜態(tài)低溫灌注液保存法到低溫機(jī)械灌注法及亞常溫、常溫機(jī)械灌注法，以及研究抗氧化生物酶在IRI的應(yīng)用。

1 IRI產(chǎn)生的機(jī)制

肝臟在機(jī)體停止供氧和葡萄糖后，細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體功能失調(diào)，隨著三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）不斷被消耗，離子泵受損，細(xì)胞內(nèi)外離子濃度梯度失衡，Na+、K+和Ca2+等離子的失衡造成細(xì)胞水腫和細(xì)胞內(nèi)各種生物酶異常激活，誘導(dǎo)細(xì)胞壞死和凋亡，釋放損傷相關(guān)分子模式（damage associated molecular patterns，DAMP）分子，并產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species ，ROS)和激活補(bǔ)體系統(tǒng)［2，6］。肝臟恢復(fù)灌注后，肝損傷并沒(méi)有隨著氧供的恢復(fù)而減輕，反而損傷加重，再灌注后的6 h內(nèi)，庫(kù)普弗細(xì)胞發(fā)揮著重要的損傷作用［7］，產(chǎn)生的ROS激活庫(kù)普弗細(xì)胞，而庫(kù)普弗細(xì)胞又能釋放出更多的ROS（ROS能直接對(duì)細(xì)胞造成損傷），使得庫(kù)普弗細(xì)胞不斷地自我激活和自我破壞，造成嚴(yán)重的細(xì)胞損傷。此外庫(kù)普弗細(xì)胞還能產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1（interleukin，IL-1），這些細(xì)胞因子能使血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞釋放ROS、并表達(dá)細(xì)胞表皮黏附分子，而且能誘導(dǎo)血小板、中性粒細(xì)胞聚集于肝血竇中，影響微循環(huán)血流，造成細(xì)胞損傷。此外活化的補(bǔ)體系統(tǒng)也能激活庫(kù)普弗細(xì)胞，并形成攻膜復(fù)合體直接破壞細(xì)胞。

再灌注后的6 ～ 48 h內(nèi)，招募的中性粒細(xì)胞、CD4+淋巴細(xì)胞釋放大量的ROS和蛋白酶造成進(jìn)一步的機(jī)體損傷和炎癥反應(yīng)，大量ROS的釋放能使大分子復(fù)合物氧化（例如細(xì)胞色素C和心磷脂），其中細(xì)胞色素C的釋放，能促進(jìn)一系列酶聯(lián)反應(yīng)［8］，造成全身各種器官損傷。研究發(fā)現(xiàn)在灌注后5 min后便可檢測(cè)到氧自由基O2-的釋放， ROS的釋放在2 ～ 6 h達(dá)到高峰［9］。此外，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，抗氧化治療對(duì)肝IRI是有效的措施，可見(jiàn)ROS在IRI的發(fā)生中起重要的調(diào)節(jié)作用，如何減少或者阻斷ROS的釋放極為關(guān)鍵［10］。

2 關(guān)于供肝再灌注方式的探索

1963年Starzl等［11］開(kāi)創(chuàng)了肝移植的先例，動(dòng)脈氧飽和度較門(mén)靜脈高，在肝移植術(shù)中采取率先開(kāi)放動(dòng)脈的方式，另外一種灌注方式是先開(kāi)放門(mén)靜脈血流，門(mén)靜脈氧飽和度雖然較低，但是門(mén)靜脈入肝血流占到70%以上，故其提供的氧氣量和動(dòng)脈相當(dāng)。2001年Sadler等［12］回顧性研究比較經(jīng)肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈先后開(kāi)放再灌注兩者之間的區(qū)別，分別比較兩者26例患者術(shù)后丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)兩者在近期或者遠(yuǎn)期肝功能指標(biāo)的對(duì)比上并沒(méi)有明顯差異，但經(jīng)肝動(dòng)脈灌注的患者生存時(shí)間較短。2003年Kniepeiss等［13］首次報(bào)道原位肝移植術(shù)中采取下腔靜脈逆灌注的方式可以改善早期移植肝功能，減少原發(fā)性移植肝無(wú)功能及再灌注綜合征的發(fā)生率。Matevossian等［14］通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)M人體肝移植全過(guò)程，發(fā)現(xiàn)同種異體肝移植通過(guò)下腔靜脈逆行灌注的方式能降低早期肝酶水平，有利于術(shù)后肝功能的恢復(fù)。同樣的國(guó)內(nèi)學(xué)者呂立志等［15］通過(guò)臨床正、逆灌注隨機(jī)研究分析證明逆灌注有助于改善肝移植IRI的發(fā)生，減少對(duì)肝細(xì)胞的損害及改善術(shù)后早期肝功能的恢復(fù)。國(guó)外學(xué)者Kern等［16］模擬大鼠原位肝移植模型，對(duì)比經(jīng)下腔靜脈逆行灌注法和常規(guī)門(mén)靜脈正向灌注法，得出大鼠原位肝移植逆灌注法能減輕肝移植IRI。但有關(guān)逆灌注對(duì)移植肝IRI具體的保護(hù)機(jī)制鮮有報(bào)道，還需要進(jìn)一步的研究及證實(shí)。

3 關(guān)于供肝保存方式的探索

傳統(tǒng)的靜態(tài)低溫保存供肝（通常是0 ～ 4℃）方式，一直沿用至今，能夠在一定程度上降低ATP的消耗（大約是12倍左右），但是無(wú)法阻止這一進(jìn)程的發(fā)展，仍會(huì)引起細(xì)胞凋亡或者壞死，這一時(shí)間通常是24 h以?xún)?nèi)，而且低溫對(duì)細(xì)胞膜脂質(zhì)、細(xì)胞骨架和線(xiàn)粒體具有直接的損害作用［17］。為了改善這一情況，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在供肝的保存上做出許多研究［18-24］。低溫（1 ～ 18℃）機(jī)械灌注（當(dāng)時(shí)的灌注液為全血）用于器官保存最早是在20世紀(jì)60年代，Belzer等［18］用于腎臟的保存，到了1967年，他們將這項(xiàng)技術(shù)提高到了另一個(gè)高度，增加氧供于其中，使得當(dāng)時(shí)腎臟的保存能達(dá)到72 h。由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)限定，灌注機(jī)械設(shè)備過(guò)大造成運(yùn)輸困難以及臨床使用的不便限制了該技術(shù)的發(fā)展，在當(dāng)時(shí)有研究表明，采用低溫機(jī)械灌注保存同靜態(tài)低溫保存相比沒(méi)有表現(xiàn)出優(yōu)點(diǎn)［19］。強(qiáng)有力的免疫抑制劑的問(wèn)世以及器官保存液的改進(jìn)，使得靜態(tài)低溫器官保存法一直沿用至今。肝臟資源的匱乏，迫使人們將邊緣性供肝（例如年齡過(guò)大、脂肪化較嚴(yán)重等）納入肝移植擴(kuò)大供肝標(biāo)準(zhǔn)（extended criteria donors ，ECD）之中，這些肝臟在低溫下更容易受到損傷，IRI帶來(lái)的危害更大，更加容易造成移植后肝功能不全甚至移植肝無(wú)功能。為了使肝臟在保存過(guò)程中盡可能地減少損傷和提高邊緣供肝的利用率及受體的存活率，Yuan等［20］將低溫機(jī)械灌注（目前主要應(yīng)用的灌注液為威斯康星大學(xué)保存液和組氨酸 -色氨酸 - 酮戊二酸鹽液）應(yīng)用于移植供肝保存之中，使用經(jīng)過(guò)改良后低溫機(jī)械灌注保存能降低細(xì)胞新陳代謝和緩解ATP消耗的速度，循環(huán)的液體能給細(xì)胞帶來(lái)新的養(yǎng)分、氧氣和帶走低溫保存下的代謝毒性產(chǎn)物，而且能隨時(shí)檢測(cè)細(xì)胞的活力。此外低溫機(jī)械灌注不僅能實(shí)時(shí)通過(guò)肝臟的流量和壓力側(cè)面反映肝臟的質(zhì)量，并能及時(shí)對(duì)此進(jìn)行藥物及基因治療，而且機(jī)械灌注模擬血管在人體內(nèi)的搏動(dòng)方式和頻率，能很好地維持血管的功能、預(yù)防再灌注后血管痙攣的發(fā)生以及維持微循環(huán)的通暢。這些優(yōu)點(diǎn)對(duì)于提高邊緣供肝的肝功能恢復(fù)和患者的存活率都是極有好處的。

從低溫到常溫，溫度的劇烈變化，容易使肝臟再次受到損傷。Bruinsma等［21］采用亞常溫機(jī)械灌注（一般為20 ～ 30℃），對(duì)低溫保存下的肝臟進(jìn)行液體復(fù)溫，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示亞常溫機(jī)械灌注有助于肝臟細(xì)胞功能的改善：氧氣的攝取、膽汁的產(chǎn)生和組織ATP含量都有明顯的提高。此外，Bea等［22］采用體外常溫肝臟機(jī)械灌注（normothermic ex vivo liver perfusion ，NEVLP） （37℃）裝置，更好地模擬了細(xì)胞所處內(nèi)環(huán)境的狀態(tài)，從而不影響肝臟的新陳代謝，極大地降低IRI給人體帶來(lái)的危害，減少人體發(fā)生肝功能不全、移植肝臟無(wú)功能和其他器官的損傷等問(wèn)題的發(fā)生［23］。同樣在2015年，研究人員成功利用體外常溫灌注肝臟技術(shù)完成10例肝移植手術(shù)，術(shù)后同傳統(tǒng)的低溫保存肝移植相比較，ALT和AST均有所下降，術(shù)后個(gè)體主要的并發(fā)癥的發(fā)生率也有所下降［24］。常溫機(jī)械灌注能在一定程度上減輕缺血/再灌注引起的損傷，但是由于其裝置較為巨大，搬運(yùn)不方便，缺乏大量的臨床數(shù)據(jù)支持，目前難以廣泛地應(yīng)用于臨床實(shí)踐之中。

4 關(guān)于抗氧化生物酶減輕氧化應(yīng)激損傷的探索

ROS是一類(lèi)來(lái)源于O2的化學(xué)反應(yīng)分子，主要代表有O2-、H2O2和 OH-［25］，ROS 在 IRI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，通過(guò)體內(nèi)抗氧化生物酶（過(guò)氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和乙醛脫氫酶）能有效地清除ROS，可能對(duì)IRI起著保護(hù)作用［9，26-27］。

4.1 過(guò)氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）：SOD和CAT能有效地清除機(jī)體產(chǎn)生的ROS。其中SOD分為銅/鋅-SOD（copper/zinc SOD ，Cu/Zn-SOD）、錳 -SOD（manganese-SOD，Mn-SOD）和細(xì)胞外-SOD（extracellular-SOD ，EC-SOD）；其中 Cu/Zn-SOD位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞內(nèi)其抗氧化作用，Mn-SOD只存在于線(xiàn)粒體中，而ROS起源于此，因此Mn-SOD是對(duì)抗氧化應(yīng)激相對(duì)重要的一種酶［28］，而EC-SOD存在于細(xì)胞外發(fā)揮其抗氧化作用，促進(jìn)O2-轉(zhuǎn)化為 O2或 H2O2，H2O2在 CAT 的作用下轉(zhuǎn)化為H2O和O2［9］，O2-不能透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，只能被EC-SOD所清除。通過(guò)增加SOD或SOD類(lèi)似物來(lái)提高SOD活性的方式可以有效地預(yù)防各種類(lèi)型的肝損傷。研究人員檢測(cè)急性和慢性肝炎時(shí)發(fā)現(xiàn)［27］，急性期時(shí)體內(nèi)SOD有明顯的上升，到了慢性期SOD水平明顯被抑制，這說(shuō)明SOD在急性肝炎的發(fā)病中也起到一定的作用，但是SOD的半衰期只有6 min［9］，無(wú)法持續(xù)地發(fā)揮清除ROS的作用。通過(guò)基因治療來(lái)提高在捐獻(xiàn)者體內(nèi)SOD表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間從而提高SOD含量和作用時(shí)間，能有效對(duì)抗肝臟缺血/再灌注引起的損傷。傳統(tǒng)的基因?qū)敕绞酱蠖嗖捎靡韵俨《緸檩d體的方式，將Cu/Zn-SOD基因以腺病毒為載體的方式導(dǎo)入人體之中能有效地保護(hù)肝IRI，但將ECSOD導(dǎo)入后，SOD水平只有輕微的升高， SOD活性并沒(méi)有顯著的增加，因腺病毒對(duì)人體具有直接損傷作用，不可能通過(guò)增加腺病毒量來(lái)提高SOD的水平。He等［9］將EC-SOD和（或）CAT基因與納米粒子載體融合，解決了腺病毒載體的缺陷，導(dǎo)入于小鼠之中，發(fā)現(xiàn)SOD 活性有明顯的提高，SOD的過(guò)表達(dá)使得血清中的ALT水平有了明顯的下降，這一作用比單獨(dú)導(dǎo)入EC-SOD或CAT基因都要明顯，間接反映了兩者之間存在協(xié)同作用，也揭示了對(duì)肝IRI起到保護(hù)作用。

4.2 乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH)：再灌注后，釋放的大量ROS，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生大量的活性醛，例如丙二醛，能夠和相關(guān)的蛋白或者DNA結(jié)合，造成肝細(xì)胞的破壞，加重肝IRI［29］。ALDH是一類(lèi)存在人體中能夠清除活性醛的酶，其中同工酶ALDH2在清除毒性醛中起主要作用，此外還能解離氧化應(yīng)激中產(chǎn)生的醛加合物。ALDH2的保護(hù)作用最先發(fā)現(xiàn)于小鼠心肌細(xì)胞IRI［30］，通過(guò)使用ALDH2的激活劑Alda-1，能使心肌梗死的面積減少60%左右。ALDH2在各種器官缺血損傷中也有保護(hù)作用，例如腦、腎、肺［29］。Zhang等［29］，將ALDH2激活劑應(yīng)用于肝移植之中，發(fā)現(xiàn)激活的ALDH2不僅起保護(hù)肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，而且能有效地減少肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)ALDH2還能減少活性醛的聚集和減輕炎癥反應(yīng)，對(duì)移植肝起一定的保護(hù)作用。此外有研究發(fā)現(xiàn)，選擇性激活A(yù)LDH2使線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ功能改變和逆電子傳遞，使線(xiàn)粒體膜電位恢復(fù)，減緩ROS的產(chǎn)生，從而起到保護(hù)肝臟 IRI的作用［29，31］。

5 “無(wú)缺血”器官移植時(shí)代的展望

為徹底解決供肝IRI，何曉順等［32］創(chuàng)新地將常溫機(jī)械灌注供肝技術(shù)同肝移植術(shù)融合，完成3例“無(wú)缺血”肝移植術(shù)，術(shù)后患者恢復(fù)情況良好，全程供肝病理未見(jiàn)明顯肝細(xì)胞壞死及凋亡，術(shù)后1周肝酶學(xué)指標(biāo)恢復(fù)正常水平，近期術(shù)后暫無(wú)膽道、血管及排斥反應(yīng)等并發(fā)癥的發(fā)生。但目前樣本含量少，遠(yuǎn)期術(shù)后效果仍不得而知，有待進(jìn)一步觀(guān)察和研究。這一革命性的突破，意味著IRI并不是完全無(wú)法避免的，為未來(lái)的移植道路指明方向，為更多需要肝移植的患者帶來(lái)福音。

6 小 結(jié)

改善再灌注手術(shù)方式、加強(qiáng)機(jī)械灌注保存供肝方法及抗氧化生物酶的應(yīng)用研究，有可能進(jìn)一步緩解移植肝IRI，有助于肝功能恢復(fù)。“無(wú)缺血”器官移植時(shí)代將值得我們期待。