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基因組編輯產(chǎn)品的安全管理

2019-02-09 08:13:08閆元元朱金潔謝傳曉劉昌林
生物工程學(xué)報 2019年6期
關(guān)鍵詞:堿基外源轉(zhuǎn)基因

閆元元,朱金潔,謝傳曉,劉昌林

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基因組編輯產(chǎn)品的安全管理

閆元元1,2,朱金潔1,謝傳曉1,劉昌林1

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081 2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 玉米研究所,四川 成都 610000

基因組編輯技術(shù)是指利用特異性核酸酶的定點剪切活性與細胞內(nèi)源DNA損傷修復(fù)活性,在基因組水平上對目的核酸序列或單個核苷酸進行定點修飾的基因工程技術(shù),該技術(shù)可以對生物體基因組進行精確敲除、插入、單堿基突變或置換等編輯。目前,基因組編輯技術(shù)具有精確性、高效性及易操作性,應(yīng)用范圍日益擴大。文中簡要概述了3種主要的基因組編輯技術(shù)工具及基因組編輯類型,介紹了美國、歐盟等國家和地區(qū)對基因組編輯產(chǎn)品的監(jiān)管體制。同時,基于我國對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全管理原則與體系,初步提出了基因組編輯產(chǎn)品的安全管理思路。根據(jù)中間材料或產(chǎn)品中是否含有外源編輯酶蛋白基因成分對基因組編輯產(chǎn)品進行分類管理,含有外源編輯酶的材料應(yīng)按現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因安全管理辦法進行管理;中間材料或產(chǎn)品中不含有Cas9等編輯酶的材料應(yīng)根據(jù)被編輯位點的特征進行具體分類管理。

基因組編輯,轉(zhuǎn)基因,安全管理

基因組編輯技術(shù)是指對基因組進行定點修飾的技術(shù),該技術(shù)可以對生物體基因組進行精確敲除、插入或置換,其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)最為突出,CRISPR/Cas9自2013年被列為年度十大科學(xué)突破之一后,始終保持高速發(fā)展,在醫(yī)藥治療、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護等方面均具有巨大的應(yīng)用潛力,是當(dāng)前生物技術(shù)的研究熱點與未來的發(fā)展方向。雖然基因組編輯技術(shù)有很高的精確性,但也存在一定程度的脫靶現(xiàn)象。目前,亟需明確基因組編輯產(chǎn)品的安全管理思路和辦法,保障基因組編輯技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)的健康有序發(fā)展。

1 基因組編輯技術(shù)

基因組編輯是一種對生物體基因組進行定點修飾、定向敲除或插入目的基因的編輯技術(shù)[1]。該技術(shù)通過精確定位基因組的目標(biāo)位點,剪斷靶標(biāo)DNA片段,實現(xiàn)插入、敲除或定點修改目標(biāo)序列。通過基因組編輯,特定敲除目標(biāo)基因、插入特定基因或者定點突變使基因失活,可以最直接有效地研究該基因功能以及它對各方面性狀的影響?;蚪M編輯技術(shù)主要包括核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN) 技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN) 技術(shù)和RNA引導(dǎo)的規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR) 技術(shù)。

ZFN是第一個針對特定DNA區(qū)段可編程的基因組編輯工具,由特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域ZFP和DNA切割結(jié)構(gòu)域Ⅰ核酸內(nèi)切酶組成。由于結(jié)構(gòu)域 ZFP能對基因組中特異性基因進行識別和定點剪切,導(dǎo)致基因DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂(Double strand break,DSB),再通過非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHEJ) 和同源重組(Homology directed repair,HDR) 修復(fù)斷裂,從而對基因組中的特定位點進行靶向編輯[2-3]。然而,ZFN的設(shè)計比較繁瑣,靶向新的DNA序列時需要定制設(shè)計新的ZFN,存在脫靶率高、成本較高和難以使用等缺點。

TALEN也是一種核酸酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù),由TALE和Ⅰ核酸內(nèi)切酶兩部分組成。其中,TALE結(jié)構(gòu)域能識別DNA特異位點并與之結(jié)合,而由Ⅰ構(gòu)成的切割域能執(zhí)行切割功能。兩者結(jié)合可使靶位點目標(biāo)基因DNA產(chǎn)生DSB,進一步誘導(dǎo)DNA損傷后修復(fù),對基因組進行靶向編輯[4]。雖然在易用性方面優(yōu)于ZFN,但其蛋白質(zhì)設(shè)計、合成和驗證工作限制了其廣泛應(yīng)用。

ZFN和TALEN的序列靶向通過蛋白質(zhì)-DNA相互作用介導(dǎo),而CRISPR/Cas系統(tǒng)募集指導(dǎo)RNA,通過堿基配對將核酸內(nèi)切酶引導(dǎo)至靶DNA序列。CRISPR/Cas系統(tǒng)大致分為3類,其中Ⅱ型系統(tǒng)的組成比較簡單,只需要Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA 三種成分即可發(fā)揮作用[5],且具有高效性和易操作性,成為目前應(yīng)用最廣泛的基因組編輯系統(tǒng)。Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特征蛋白為Cas9,Cas9蛋白具有RuvC和HNH兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域,負責(zé)切割靶DNA的兩條鏈,從而造成雙鏈的斷裂。其中HNH結(jié)構(gòu)域負責(zé)切割與crRNA互補的DNA鏈,切割位點位于原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif,PAM)上游3 bp處,RuvC結(jié)構(gòu)域負責(zé)切割非互補鏈,切割位點位于PAM上游3–8 bp處。Cas9蛋白同時具有加工產(chǎn)生crRNA以及切割外源核酸的功能[6]。crRNA通過堿基配對與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物,研究者可以將tracrRNA和crRNA作為兩種向?qū)NA (gRNA) 或者融合在一起形成單向?qū)NA (single guide RNA,sgRNA)。sgRNA能夠與Cas9核酸內(nèi)切酶結(jié)合并將Cas9引導(dǎo)至基因組上對靶位點進行切割。CRISPR/Cas9系統(tǒng)使目標(biāo)基因DNA產(chǎn)生DSB,特異性DSB會激活細胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機制,包括易錯的NHEJ修復(fù)和高保真的HDR修復(fù)。目前,CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被成功運用到玉米[7]、小麥[8]、水稻[9]、大豆[10]、煙草[11]和擬南芥[12]等植物中,與其他編輯技術(shù)相比,其成本低、制作簡便、快捷高效的優(yōu)點,成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。

2 基因組編輯的類型

2.1 單堿基替換

單堿基變異是作物許多重要農(nóng)藝性狀發(fā)生突變的遺傳基礎(chǔ),常導(dǎo)致氨基酸的替換或蛋白質(zhì)翻譯終止,使基因功能發(fā)生改變,從而產(chǎn)生新性狀。2016年4月,哈佛大學(xué)David Liu首先報道了基于胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1) 與CRISPR/Cas9融合形成的單堿基編輯技術(shù)(Base editor,BE)。該技術(shù)將Cas9與胞嘧啶脫氨酶融合,并通過sgRNA將融合蛋白靶向靶位點,在不切割雙鏈DNA的情況下,在一定的突變窗口內(nèi)對靶基因位點實現(xiàn)胞嘧啶(Cytosine,C) 到胸腺嘧啶(Thymine,T)的單堿基轉(zhuǎn)換[13],研發(fā)了第一代編輯系統(tǒng)(BE1),但效率不高。在此基礎(chǔ)上,他們通過融合尿嘧啶糖苷酶抑制蛋白(Uracil DNA glycosylase inhibitor,UGI) 形成了第二代編輯系統(tǒng)(BE2),同時將dCas9突變?yōu)镃as9n (D10A),進一步優(yōu)化產(chǎn)生了 BE3。2017年8月,David Liu實驗室又在 BE3 基礎(chǔ)上通過進一步優(yōu)化連接(Linker) 序列,同時增加一個拷貝的UGI,形成了BE4系統(tǒng)[14]。其中他們實驗室報道的BE3效率最高。同年11月,Li等[15]首先利用BE3系統(tǒng)構(gòu)建植物表達載體,以水稻和為靶標(biāo)基因進行單個堿基定點替換研究,效率最高可達20%左右。中國科學(xué)院高彩霞研究組也隨后報道了借鑒哺乳動物單堿基編輯方法,利用改造后的Cas9蛋白(nCas9- D10A) 融合大鼠胞嘧啶脫氨酶(rAPOBEC1) 和UGI,構(gòu)成了高效的植物單堿基編輯系統(tǒng)nCas9-PBE,成功在小麥、水稻和玉米三大重要農(nóng)作物基因組中實現(xiàn)高效、精確的單堿基定點突變[16]。同時,朱健康研究組在APOBEC1功能的基礎(chǔ)上,對兩個編碼重要農(nóng)藝性狀的水稻基因和進行C→T或C→G的單堿基編輯,替換的效率為1.4%–11.5%[17]。

為了將單堿基編輯系統(tǒng)更好地應(yīng)用于研究中,2017年10月,David Liu又報道了可通過將腺苷脫氨酶與Cas9融合實現(xiàn)腺嘌呤(A) 到鳥嘌呤(G)轉(zhuǎn)換的單堿基編輯系統(tǒng)(Adenine base editor,ABE)。該系統(tǒng)可將PAM (NGG) 上游12–17 bp處的腺嘌呤脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤?,肌苷可與C配對,在DNA水平被當(dāng)成G進行識別與復(fù)制,實現(xiàn)在突變窗口內(nèi)A到G的突變。研究者經(jīng)過多次篩選,構(gòu)建了在人類細胞中編輯效率可達50%左右的高精確度的單堿基編輯系統(tǒng)[18]。2018年2月,朱健康研究組通過ABE單堿基編輯系統(tǒng)成功地對水稻基因組中的和位點進行了單堿基編輯,A·T到G·C的替換的效率分別為26%和12.5%[19]。同年5月,高彩霞研究組在前期研究的基礎(chǔ)上,利用nCas9-D10A融合大腸桿菌野生型腺嘌呤脫氨酶(ecTadA) 和人工定向進化的腺嘌呤脫氨酶(ecTadA*) 二聚體,建立了ABE單堿基編輯系統(tǒng),在水稻和小麥中實現(xiàn)了高效的A·T到G·C堿基的替換,并獲得了通過植物ABE系統(tǒng)編輯的具有除草劑抗性的水稻和小麥植株[20]。隨后,韓國科技大學(xué)的Jin-Soo Kim團隊也成功實現(xiàn)了擬南芥和油菜L.基因組A→G的堿基替換,這將為植物基因組編輯提供更多的工具選擇[21]。單堿基編輯系統(tǒng)在植物中的成功利用,有望大大加快農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀的改良進程,具有重要的應(yīng)用前景。

2.2 寡核苷酸插入或缺失

CRISPR/Cas9系統(tǒng)使目標(biāo)基因DNA產(chǎn)生DSB,特異性DSB會激活細胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)機制,由非同源末端連接(NHEJ) 介導(dǎo)的修復(fù)過程通常會導(dǎo)致非特異性的插入、缺失或其他突變。2016年,朱健康課題組利用CRISPR/Cas9技術(shù)在兩個廣泛種植的優(yōu)良粳稻品種秀水134和9522中將基因進行突變。研究結(jié)果表明,基因的突變會導(dǎo)致這兩個品種中的直鏈淀粉含量降低,將非糯稻變成糯稻[22]。2017年,謝傳曉課題組利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù),對玉米() 基因第1外顯子序列進行定向突變,產(chǎn)生基因敲除突變,獲得了葉片夾角表型減小的突變植株[23]。

2.3 多位點編輯

基于轉(zhuǎn)錄后gRNA和Cas9是分離的,各個gRNA具有獨立性的特點,CRISPR/Cas9系統(tǒng)可在同一個體中實現(xiàn)多基因或多位點同時敲除。多位點編輯可提高復(fù)雜數(shù)量性狀基因功能研究的效率,構(gòu)建多基因缺失突變體,有利于功能冗余的家族基因研究和多倍體物種的研究。通過高效驅(qū)動多個gRNAs,可以實現(xiàn)作物重要農(nóng)藝性狀的遺傳改良。

2015年,劉耀光課題組構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)可以在單子葉植物和雙子葉植物中實現(xiàn)高效的多重基因組編輯,利用該系統(tǒng),研究人員在水稻中分別編輯了46個靶位點,突變率平均為85.4%[24]。2017年,侯文勝課題組利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯大豆開花調(diào)控途徑中3個關(guān)鍵的整合因子,介導(dǎo)產(chǎn)生提前終止密碼子引起mRNA降解,最終篩選獲得了“無外源基因(Transgene-clean)”的定點敲除晚花突變體,這類突變體不含有轉(zhuǎn)基因元件,表型顯著且能穩(wěn)定遺傳[25]。該研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實現(xiàn)大豆重要農(nóng)藝性狀遺傳改良,為大豆基因組編輯技術(shù)的育種應(yīng)用提供了成功例子。2018年,堪薩斯州立大學(xué)的科研人員針對小麥粒長、粒寬和粒重等有關(guān)的基因和與小麥白粉病等有關(guān)的、基因,利用串聯(lián)重復(fù)的tRNA-gRNA單元構(gòu)建的編輯載體,成功實現(xiàn)了六倍體小麥3個基因的同時敲除[26]。

2.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的大片段編輯

隨著基因組編輯技術(shù)的不斷發(fā)展,除了通過引入寡核苷酸插入缺失變異來敲除基因功能外,CRISPR/Cas9還可以用來創(chuàng)建染色體異常(如大片段缺失、易位、倒位) 的突變體。Zhou等[27]利用CRISPR/Cas9和一對gRNA從水稻染色體上刪除了1個115–245 kb大片段,其中包含了2–3個不同的基因簇,且該突變被穩(wěn)定地遺傳到所有T2代植株。由于此技術(shù)在引起DSB和隨后的靶基因組編輯方面達到極高的效率,一些T0植物可以直接用于生物實驗,減少基礎(chǔ)生物學(xué)實驗所需的時間。

粳稻中的()突變基因,能促進細胞分裂,使得植株稻穗變密、枝梗數(shù)增加和每穗籽粒數(shù)增多,從而促使水稻增產(chǎn)。為了使秈稻增產(chǎn),先正達生物科技 (中國) 有限公司的研發(fā)人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)對秈稻中的基因進行了突變,研究結(jié)果表明他們成功造成了基因上10 kb大片段的缺失,且編輯效率超過9%,并得到了具有增產(chǎn)潛力的編輯后水稻材料[28]。

朱健康研究組對2個編碼擬南芥甲基化酶的內(nèi)源基因和分別進行了4個外源大片段敲入測試,其中在ROS1蛋白C端分別敲入720 bp的綠色熒光蛋白GFP和長達1 653 bp的熒光素酶蛋白LUC,測試均獲得穩(wěn)定可遺傳的單株,它可以在擬南芥基因組精準(zhǔn)定向地實現(xiàn)氨基酸或大片段的插入或替換,效率高達5%–10%[29]。

2.5 CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

研究者將CRISPR-Cas9系統(tǒng)中Cas9蛋白的兩個核酸內(nèi)切酶活性的結(jié)構(gòu)域HNH和RuvC進行H840A和D10A定點突變,獲得只有DNA結(jié)合能力的蛋白dCas9,使該系統(tǒng)具有了調(diào)控基因表達的新功能[30]。

2013年,加州大學(xué)舊金山分校的研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR技術(shù)可以用于真核細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究,并在人類和酵母細胞中均得到證實[31]。2015年,Lowder等[32]將dCas9與病毒轉(zhuǎn)錄激活因子Vp64融合,通過擬南芥的瞬時表達,表明dCas9-VP64成功地激活了基因的表達。為了提高轉(zhuǎn)錄激活效率,Konermann等[33]重新設(shè)計了CRISPR/dCas9激活復(fù)合體,使之可以大幅度提高轉(zhuǎn)錄激活效率,在人類細胞中實現(xiàn)同時激活10個內(nèi)源基因,并能夠上調(diào)長鏈非編碼RNA (lncRNA) 的轉(zhuǎn)錄水平。Baazim等[34]則在煙草的瞬時轉(zhuǎn)化中采用CRISPR/dCas9系統(tǒng),將dCas9的C-末端與激活結(jié)構(gòu)域EDLL或TAD融合,結(jié)果表明dCas9-EDLL融合蛋白或dCas9-TAD融合蛋白可以激活基因或基因的表達。同時,該團隊將dCas9的C-末端與轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)域SRDX融合,證明dCas9-SRDX融合蛋白可以抑制基因的表達。

3 基因組編輯產(chǎn)品的安全管理

以CRISPR/Cas9為代表的基因組編輯技術(shù)是近年來發(fā)展的新技術(shù),世界各國還沒有明確的、針對性的法律法規(guī),目前全球各國對于基因組編輯產(chǎn)品的安全性及其監(jiān)管政策仍然處于形成的過程中,不同國家關(guān)于基因組編輯產(chǎn)品的政策存在很大差別。

3.1 國外監(jiān)管體制

目前對于基因組編輯產(chǎn)品的監(jiān)管尚未達成全球共識,作為全球轉(zhuǎn)基因作物第一種植大國,美國的監(jiān)管原則側(cè)重于管理轉(zhuǎn)基因技術(shù)的產(chǎn)品,而不是研發(fā)、生產(chǎn)過程,在確保公共安全的同時,也不會因過于嚴苛的管理而妨礙技術(shù)發(fā)展。食品藥品監(jiān)督管理局對于基因組編輯產(chǎn)品的審查則是根據(jù)適用于各個類型產(chǎn)品的具體法規(guī),維持以產(chǎn)品為中心、以科學(xué)為基礎(chǔ)的監(jiān)管政策,同時遵循美國政府總體的政策原則[35]。而美國環(huán)境保護署則認為,如果應(yīng)用基因組編輯技術(shù)賦予作物抗蟲抗病特性,則需要進行個案分析。2018年,美國農(nóng)業(yè)部發(fā)表聲明,表示不會對一些未利用植物害蟲的新技術(shù)培育的農(nóng)作物進行監(jiān)管,其中包括基因組編輯技術(shù),在9月份該機構(gòu)表示,它不會對營養(yǎng)質(zhì)量改善的TALEN編輯的苜蓿品種進行管理。美國的Calyxt公司擁有6種不受管制的TALEN編輯作物[36]。

阿根廷2015 年的政策建立了個案分析的咨詢程序,以確定產(chǎn)品是否屬于轉(zhuǎn)基因生物法規(guī)的監(jiān)管范圍。申請人有兩種選擇,第一種適用于仍處于設(shè)計階段的項目。申請人提交初步咨詢,目標(biāo)是預(yù)測假設(shè)的預(yù)期產(chǎn)品是否屬于轉(zhuǎn)基因生物,在此情況下,政府評估部分基于開發(fā)人員的期望,只具有初步狀態(tài)。當(dāng)最終獲得新作物時,申請人必須返回監(jiān)管機構(gòu)并提交關(guān)于實際產(chǎn)生的遺傳修飾的事實確定。只有在產(chǎn)品具有初步調(diào)查中預(yù)期的功能的情況下,才會保留早期關(guān)于其監(jiān)管狀態(tài)的評估。第二種是按照現(xiàn)行對GMO申請的要求提交完整的申報書,申請人應(yīng)提交詳細數(shù)據(jù),以確定育種過程的結(jié)果是否是遺傳物質(zhì)的新組合,該程序為60個工作日的時間限制。如果最終植物不含有由基因編輯技術(shù)引入的外源DNA,將不受監(jiān)管[37]。

加拿大和阿根廷一樣被認為有基于產(chǎn)品的法規(guī)。其生物技術(shù)監(jiān)管框架可追溯至1993年,基于新性狀植物(PNT) 觸發(fā)監(jiān)管機制。加拿大的監(jiān)管機制對于傳統(tǒng)的基因突變產(chǎn)品或基因編輯產(chǎn)品,不論產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)如何,僅針對于產(chǎn)品在食用和環(huán)境等方面是否有新性狀進行監(jiān)管[37]。日本則認為如果證實最終產(chǎn)品中不含有轉(zhuǎn)基因成分,該產(chǎn)品則被認為與傳統(tǒng)突變育種所得的產(chǎn)品相同。然而,對于目標(biāo)基因不夠明確時,研發(fā)者應(yīng)該提前向監(jiān)管機構(gòu)提供相關(guān)信息,必要時接受來自專家的科學(xué)評估[38]。

新西蘭采用嚴格的過程驅(qū)動的監(jiān)管框架即1996年的有害物質(zhì)和新生物(HSNO) 法案來管制轉(zhuǎn)基因生物。2012年,Scion根據(jù)其中第26條,要求環(huán)境保護局(EPA) 決定,有機體是否在新西蘭受到GM的監(jiān)管[39]。2013年,EPA認為Scion提出的非轉(zhuǎn)基因基因編輯方法與化學(xué)誘變和遺傳操作具有相似性,在編輯過的植物中沒有外來DNA,因此通過基因編輯方法生產(chǎn)的植物,不會被視為轉(zhuǎn)基因生物[40],然而美國環(huán)保署對此提出上訴,高等法院最終裁定認為基因編輯產(chǎn)品仍然需要像傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品一樣接受復(fù)雜的監(jiān)管[41]。

歐盟歷來對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品持相對保守的態(tài)度。2013年,在歐盟主管部門的要求下,針對不能確定產(chǎn)物是否為轉(zhuǎn)基因的生物技術(shù),設(shè)立了新技術(shù)工作組;隨后,歐盟委員會要求轉(zhuǎn)基因作物需通過歐盟指令2001/18/EC (2001) 和EC法規(guī)258/97 (1997) 的詳細程序進行監(jiān)管審查,這些被認為是基于過程的轉(zhuǎn)基因生物法規(guī)[42-44]。2018年7月,歐盟最高法院通過了一項決議,要求基因組編輯作物必須接受與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物同樣嚴格的監(jiān)管[45]。

3.2 我國對基因組編輯產(chǎn)品的安全管理觀點

近年來,基因組編輯技術(shù)發(fā)展迅速,使基因精準(zhǔn)修飾成為現(xiàn)實,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥治療和環(huán)境保護等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。2016年李家洋院士等提出了基因組編輯技術(shù)的管理框架,包括以下5項要點:1) 各試驗環(huán)節(jié)應(yīng)該在隔離的密閉環(huán)境中進行,盡可能防止材料傳播到外界;2) 如果在產(chǎn)品前期引入Cas核酸酶等外源DNA,必須確保最終產(chǎn)品中不含有外源基因;3) 記錄目標(biāo)基因的靶位點處DNA序列變化,如果引入外源DNA,必須注明供體和受體的親緣關(guān)系,如果親緣關(guān)系很遠,則根據(jù)具體情況具體分析;4) 通過全基因組測序記錄基因組編輯引起的除靶位點外的所有序列變化,分析脫靶效應(yīng)防止產(chǎn)生預(yù)期之外的編輯;5) 申請中咨詢者應(yīng)該詳細說明以上4點。滿足上述5個基本條件時,基因組編輯產(chǎn)品可以按照常規(guī)育種品種對待,不需要進行監(jiān)管[46]。

3.3 基因組編輯產(chǎn)品的分類管理

近年來基因組編輯技術(shù)不斷創(chuàng)新發(fā)展,已在植物基因功能研究、作物育種等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,特別是RNA介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù),已被廣泛應(yīng)用于培育具有優(yōu)良性狀的基因組編輯大豆、大麥、蘑菇和玉米等產(chǎn)品。隨著基因組編輯作物不斷從實驗室走向田間,圍繞著基因組編輯作物的安全評價和監(jiān)管態(tài)度也成為急需解決的問題。

綜合國際國內(nèi)已有政策和觀點,作者認為基因組編輯作物應(yīng)根據(jù)中間材料或產(chǎn)品基因組中是否含有外源編輯酶蛋白等轉(zhuǎn)基因成分進行分類管理。含有外源編輯酶蛋白的材料,與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理方法應(yīng)一致;中間材料或產(chǎn)品基因組中不含有Cas9編輯酶等轉(zhuǎn)基因成分,該類材料應(yīng)根據(jù)被編輯位點的特征再次進行分類管理。

3.3.1 含有Cas9編輯酶等轉(zhuǎn)基因成分的產(chǎn)品安全管理

含有Cas9等編輯酶的產(chǎn)品管理方法應(yīng)與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品管理方法一致[33-35],即參照首先根據(jù)植物、動物和微生物分類別,然后根據(jù)受體生物和轉(zhuǎn)基因操作的安全性分等級,再結(jié)合試驗研究、中間試驗、環(huán)境釋放、生產(chǎn)性試驗和生產(chǎn)應(yīng)用安全證書等進行分階段,并按照個案分析的原則進行管理。

3.3.2 不含有Cas9等編輯酶的產(chǎn)品管理

對于不含有Cas9等編輯酶的基因組編輯產(chǎn)品應(yīng)根據(jù)被編輯位點的不同進行分類管理。通過CRISPR/Cas9技術(shù)可以實現(xiàn)基因的定點編輯,被定點編輯的基因可以穩(wěn)定遺傳到下一代,不影響其他性狀又無外源基因的表達,這與傳統(tǒng)的雜交作物本質(zhì)上沒有區(qū)別。因編輯位點和CRISPR/Cas9載體整合位點常位于不同染色體,通過后代自交或與野生型雜交,可分離獲得不含有任何轉(zhuǎn)基因痕跡(去除CRISPR/Cas9) 的定點改造突變體。張毅等[47]在小麥中報道了無轉(zhuǎn)基因成分的基因組編輯,建立了一種新的通過瞬時表達CRISPR/Cas9而高效突變目標(biāo)基因的技術(shù),獲得了無外源基因整合、具有育種應(yīng)用價值的后代材料。2016年,杜邦先鋒公司將CRISPR/Cas9蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復(fù)合體(RNP),再利用基因槍轉(zhuǎn)化玉米未成熟胚細胞,得到全程無DNA載體的葉舌缺失型玉米[48]。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的同源重組和后代分離,獲得了不含有任何轉(zhuǎn)基因片段的抗除草劑水稻[49]。2017年,高彩霞等[50]將CRISPR/ Cas9蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復(fù)合體,利用基因槍法將CRISPR/Cas9 RNP轉(zhuǎn)入小麥細胞中,成功地在小麥中建立了全程無外源DNA的基因組編輯體系。同年10月,冷泉港實驗室的番茄育種家利用CRISPR/Cas9體系,通過定點修飾順式調(diào)控序列實現(xiàn)了對番茄數(shù)量性狀的精準(zhǔn)操控,這種新創(chuàng)制的順式調(diào)控序列等位變異能夠在非轉(zhuǎn)基因后代中得到固定[51]。

單堿基編輯或寡核苷酸插入缺失的基因組編輯產(chǎn)品沒有引入外源基因,因此不會產(chǎn)生新的蛋白,它們只是突變植物本身的基因,而且更為精確,所以本質(zhì)上與傳統(tǒng)的誘變育種一樣,對于這類產(chǎn)品應(yīng)該簡單審查或備案,不需要接受嚴格的監(jiān)管。但同時適當(dāng)考慮脫靶效應(yīng),在植物中可以通過全基因組測序分析脫靶效應(yīng),也可以通過回交轉(zhuǎn)育減輕脫靶效應(yīng)。2016年,賓夕法尼亞大學(xué)的楊亦農(nóng)利用CRISPR/Cas9編輯技術(shù)獲得了抗褐變白色雙孢菇,該產(chǎn)品不需要通過法規(guī)機構(gòu)的監(jiān)管程序,直接進行種植和銷售,與基因工程不同的是,這類蘑菇通過刪除目標(biāo)基因中幾個堿基實現(xiàn),沒有外源DNA殘留,這是第一例得到美國政府上市許可的CRISPR基因組編輯生物[52]。最近,美國農(nóng)業(yè)部又豁免了一系列基因編輯產(chǎn)品[36]。

定點引入外源基因的基因組編輯產(chǎn)品應(yīng)該按照傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理,因為引入外源基因后會產(chǎn)生新的蛋白,在一定程度上和傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因的本質(zhì)一樣。目前,科學(xué)家已經(jīng)實現(xiàn)利用基因組編輯技術(shù)定點插入大片段DNA。例如,2009年,Shukla等[53]利用ZFN技術(shù)將一種抗除草劑基因?qū)胗衩谆蚪M的靶位點,破壞玉米中的,獲得了抗除草劑和肌醇六磷酸水平降低的植株,替換效率達10%,可穩(wěn)定遺傳,該方法可應(yīng)用于玉米基因組中≥1 kb的任何基因座。2014年,朱健康研究組對2個編碼擬南芥甲基化酶的內(nèi)源基因和分別進行了4個外源大片段敲入測試,其中在ROS1蛋白C端分別敲入720 bp的綠色熒光蛋白GFP和長達1 653 bp的熒光素酶蛋白LUC,測試均分別獲得了穩(wěn)定可遺傳的單株系[27]。

4 結(jié)論

基因組編輯產(chǎn)品是一種新興事物,隨著基因組編輯技術(shù)的研發(fā),基因組編輯產(chǎn)品日益豐富,在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和環(huán)境保護等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值。基因組編輯產(chǎn)品的監(jiān)管急需解決,法律法規(guī)無疑是人類控制和應(yīng)對基因組編輯產(chǎn)品安全風(fēng)險的重要手段,但各國對基因組編輯產(chǎn)品的態(tài)度存在較大差異。綜合國內(nèi)國際的觀點和政策,作者認為對基因組編輯產(chǎn)品的安全管理,應(yīng)在科學(xué)的基礎(chǔ)上,根據(jù)基因組編輯產(chǎn)品的特征進行分類管理,既要考慮基因組編輯產(chǎn)品的安全性,又不能阻礙基因組編輯技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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Regulatory framework of genome-edited products – a review

Yuanyuan Yan1,2, Jinjie Zhu1, Chuanxiao Xie1, and Changlin Liu1

1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China 2 Maize Research Institute, Sichuan Agricultural University, Chengdu 610000, Sichuan, China

Genome editing is a genetic engineering technique that uses site-directed cleavage activity of specific artificial nucleases and endogenous DNA damage repair activity to generate insertions, deletions or substitutions in the targeted genomic loci. As the accuracy and efficiency of genome editing is improving and the operation is simple, the application of genome editing is expanding. This article provides an overview of the three major genome editing technologies and genome editing types, and the regulatory frameworks for genome-edited products were summarized in the United States, the European Union, and other countries. At the same time, based on the Chinese safety management principles and systems for genetically modified organisms (GMOs), the authors proposed a regulatory framework for genome-edited products. Genome-edited products should first be classified according to whether containing exogenous genetic components such as Cas9 editing enzymes or not. They should be regulated as traditional genetically modified organisms if they do. Otherwise, the regulation of genome-edited products depends on targeted modifications.

genome editing, transgene, safety regulation

October 12, 2018;

January 30, 2019

National Transgenic Major Project of China (No. 2016ZX08011003).

Changlin Liu. Tel: +86-10-82107464; Fax: +86-10-82106748; E-mail: liuchanglin@caas.cn

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(No. 2016ZX08011003) 資助。

10.13345/j.cjb.180418

閆元元, 朱金潔, 謝傳曉, 等. 基因組編輯產(chǎn)品的安全管理. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(6): 921–930.

Yan YY, Zhu JJ, Xie CX, et al. Regulatory framework of genome-edited products – a review. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 921–930.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

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