童匯慧，張威迪，胡惠文，程 逵

(1.浙江工商大學，浙江 杭州 310027；2.浙江大學材料科學與工程學院，浙江 杭州 310027)

1 前 言

醫(yī)用縫合線是外科手術中必不可少的醫(yī)療耗材，其性能的優(yōu)劣對術后恢復等具有很大影響。人體術后縫合部位由于細菌殘留等原因可能會產(chǎn)生細菌感染[1-2]，而細菌感染的過程常為細菌先期附著于植入材料表面，進而形成一層“生物膜”保護細菌，之后細菌繁殖、遷移感染周圍組織。在這種情況下，注射或口服抗生素藥物，不僅抗菌效果有限，而且全身性的藥物使用會產(chǎn)生一定的副作用，有可能會導致細菌的耐藥性等[3]。

因此，對于醫(yī)用縫合線而言，采用縫合線表面載抗菌藥，將有可能使藥物直接作用于細菌，提升殺菌和抑菌的效果，并通過抑制“生物膜”的形成抑制細菌感染的進一步發(fā)展，是一種直接而高效地抑制細菌染的方式[2，4-6]。

采用簡單的表面吸附方式可以在手術縫合線負載一層抗菌藥物，但藥物大多在與體液接觸初期爆發(fā)性釋放，初始濃度過大、持續(xù)釋放性能差。這既不利于傷口恢復，也不利于縫合線表面抗菌作用的持續(xù)[7]。Hammond教授研究組[8]利用噴涂層層組裝技術，以抗生素萬古霉素、生物多糖等作為構筑基元在醫(yī)用繃帶表面沉積了負載有萬古霉素的聚合物膜。而且，表面沉積的藥物膜使得醫(yī)用繃帶表面更光滑，萬古霉素藥物分子可以隨著聚β胺酯的降解而釋放出來，保持良好的藥物活性，對引起傷口感染的病菌有著顯著的抑制效果。因此，抗菌時效與縫合線作用相吻合的抗菌表面的構建對醫(yī)用縫合線具有重要的意義。

近年來，貽貝等生物的粘附性引起廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)，此類粘附特性主要來源于3，4-二羥基-1-苯丙氨酸和富含賴氨酸的蛋白質(zhì)[9]。而與3，4-二羥基-1-苯丙氨酸結構相似的多巴胺同樣可以在各種無機和聚合物表面形成聚多巴胺(PDA)薄膜[10]。一般認為，單體多巴胺在堿性溶液中(p H＞7.5)被氧化而自發(fā)自聚合是其主要原因：多巴胺的鄰苯二酚基團被氧化形成醌鍵，生成多巴胺醌化物；之后多巴胺醌化物和多巴胺之間產(chǎn)生歧化反應，生成半醌自由基，然后偶合形成交聯(lián)鍵，進一步增加了它的內(nèi)聚力，從而形成了緊密的交聯(lián)復合層[11]。這種機制可以方便地將PDA 粘附到多種不同種類材料表面[12]，且反應條件非常溫和，適用條件也非常廣泛。

PDA 同時具有良好的生物相容性、可降解性及細胞響應性[13]，非常適用于固載抗菌物質(zhì)形成具有抗菌性能的表面。Mao等[14]在棉織物表面利用PDA 的還原性沉積生成了銀納米顆粒，制造出抗菌棉織物，在大腸桿菌抗菌測試中幾乎可以殺死所有細菌，并且洗滌30次后，仍能持續(xù)殺死99.9%的大腸桿菌。Sileika等[15]通過在聚碳酸酯基板沉積PDA 厚薄膜，隨后嫁接聚乙二醇支鏈并在硝酸銀溶液中反應使銀納米粒子沉積PDA 涂覆的基材上，所得到的涂層不僅具備殺菌性還能抑制細菌的附著。然而，考慮到醫(yī)用縫合線需植入人體，采用納米顆粒進行抗菌還需進一步研究。

鑒于此，本研究利用PDA 的特性，將三氯生(TCS，二氯苯氧氯酚，C12H7Cl3O2，)固載于醫(yī)用縫合線表面形成了抗菌涂層，并對其固載特性和抗菌特性進行研究和討論。

2 實 驗

2.1 表面涂層制備與表征

涂層制備所需的原料試劑均為市售，TCS，純度為97%；鹽酸多巴胺，純度為98%，無水甲醇、Tris均為分析純，醫(yī)用縫合線為聚乙醇酸(PGA)。

首先，量取150m L去離子水，加入182.1mg三羥甲基氨基甲烷(Tris)到水溶液中調(diào)節(jié)溶液p H 值至弱堿性，待Tris攪拌溶解后，按設定比例加入鹽酸多巴胺，形成PDA 溶液；之后將適量TCS溶解于乙醇中，形成TCS乙醇溶液；將兩種溶液混合形成混合溶液，封口并留下氣孔，并不斷攪拌。24h后，將醫(yī)用縫合線截取適當長度后，放入前述混合溶液中，37℃烘箱靜置24h。取出后用去離子水沖洗后烘干，即獲得具有PDA-TCS涂層的縫合線?？p合線表面形貌采用掃描電子顯微鏡(SU-70，SEM)觀察，并利用電子能譜儀(EDS)分析表面成分的變化。

2.2 TCS的體外釋放實驗

將具有PDA-TCS涂層的縫合線精確稱取質(zhì)量后放入20m L混合磷酸鹽緩沖液(PBS)中，置于37℃烘箱中。分別在浸泡4h、8h、1d和2d后將對應的醫(yī)用縫合線取出，用去離子水沖洗去除表面殘余PBS緩沖液后放入烘箱中烘干。之后，通過甲醇溶液超聲處理50min提取縫合線表面的殘余TCS，并利用紫外-可見吸收光譜(Shimadzu UV1800，UV-Vis)測定其吸光度，按照標準曲線計算TCS含量并換算成縫合線表面浸泡后剩余的TCS 量。標準曲線采用已知濃度的TCS甲醇溶液在UV-Vis光譜中280nm 左右處的吸收峰強度進行繪制，如圖1所示。

圖1 TCS濃度測量標準曲線Fig.1 Standard curve of concentration determination

2.3 體外抗菌實驗

采用體外抗菌實驗評價表面PDA-TCS涂層的抗菌效果。先用無菌棉拭子蘸取1.5×106個/m L 菌液，用棉拭子均勻涂抹整個瓊脂培養(yǎng)基表面，反復3次，每次將平板旋轉(zhuǎn)60°，最后沿周邊旋轉(zhuǎn)2圈，待平面上的水分被瓊脂完全吸收后，再用無菌鑷子將滅菌后的縫合線放在固體培養(yǎng)基平板上，每個樣品間距不少于24mm，樣品中心距邊緣不少于15mm，在細菌接種后15min內(nèi)貼完。然后置于37℃保溫箱中分別培養(yǎng)1、3和7d，觀察抑菌圈的范圍，以評價具有涂層的縫合線的抗菌性能。

3 結果與討論

3.1 PDA-TCS涂層表面形貌及TCS含量

縫合線表面初始為淺藍色，經(jīng)溶液浸泡后表面轉(zhuǎn)變?yōu)樯钭厣?，如圖2所示。EDS分析顯示，涂層中有較高含量的Cl元素。由于縫合線本身不含Cl，能譜結果證明縫合線表面已有TCS的存在。進一步對典型形貌(5g/L的溶液浸泡)的觀察顯示(圖3)，組成縫合線的纖維表面變得較為粗糙，且在高放大倍數(shù)下，可以進一步觀察到其表面形成了較多的顆粒析出。綜合考慮涂層制備過程、多巴胺的自聚合過程、縫合線表面轉(zhuǎn)變?yōu)樽厣约癟CS不溶于水等特性，縫合線表面形成了PDA-TCS涂層。

圖2 縫合線及表面化學成分Fig.2 Appearance and surface chemical composition of the suture

圖3 PDA-TCS涂層的表面形貌照片F(xiàn)ig.3 Typical surface morphology of coated suture

圖4為不同濃度的TCS 對PDA-TCS 涂層表面形貌的影響。從圖可見，縫合線的表面形貌隨著溶液中TCS含量的變化而產(chǎn)生顯著變化。隨著溶液中TCS含量的增加，縫合線紡織纖維的表面逐漸變的更為粗糙，表面覆蓋膜層及顆粒量顯著增加。利用EDS計算而來的Cl元素原子百分含量結果顯示，隨著浸泡溶液中TCS含量的增加，表面Cl元素含量從1.0%逐漸增加到1.2%、1.6%和1.7%。這與SEM 的觀察結果完全一致。這顯示，縫合線表面的TCS含量可以通過浸泡溶液中的TCS含量進行調(diào)控。

圖4 TCS濃度對PDA-TCS涂層表面形貌的影響照片(a)3g/L；(b)4g/L；(c)5g/L；(d)6g/LFig.4 Effect of TCS concentration on surface morphology of the coated suture (a)3g/L；(b)4g/L；(c)5g/L；(d)6g/L

3.2 PDA-TCS涂層的穩(wěn)定性及TCS的釋放行為

為了進一步研究縫合線表面的TCS在體液中的穩(wěn)定性和釋放特性，采用模擬體液浸泡的方案，將具有PDA-TCS涂層的縫線放入PBS緩沖液中，并保持在37℃烘箱中，分別研究在浸泡4h、8h、1d和2d后的表面氯含量，并觀察其表面形貌的變化。

根據(jù)圖1的標準曲線，可以獲得縫合線表面經(jīng)不同浸泡時間TCS釋放量。對檢測模擬生理條件下(PBS，p H=7.4)涂層的體外累計釋放特性分析如圖5所示。從圖可見，TCS的釋放與涂層負載的TCS含量相關，相對TCS含量較高的涂層在浸泡初期即釋放出負載量近60%以上的TCS。而TCS含量相對較低的涂層僅釋放出約40%。但隨著浸泡時間的延長，涂層所釋放出的TCS相對量趨于一致。究其原因，可能是第一階段為接近PDA涂層表層的TCS的釋放，然后隨著時間的延長，由于鍵合作用吸附在PDA 上面的TCS，隨著PDA的逐漸降解隨之釋放，而這個過程進行得較為緩慢。這種釋放行為顯示，部分與PDA 結合的TCS可以較為穩(wěn)定地存在于涂層之中，而涂層降解較為緩慢，這對于縫合線具有長效地有抗菌作用是十分有益的。

圖5 醫(yī)用縫線表面TCS的釋放Fig.5 Release of TCS from suture surface

如圖6的掃描電鏡表面形貌分析所示，在包覆完畢后，縫線表面的PDA 涂層厚且覆蓋廣，可以觀察到縫線纖維本身的結構幾乎都被遮蓋。在釋放4h后，表面的涂層有部分減少，但仍覆蓋了縫線的絕大部分面積，且纖維與纖維之間可以明顯觀察到涂層在縫隙處減少。在釋放1d后，這種情況尤為明顯，已露出了縫合線原有的纖維之間的空隙，這顯示涂層的部分溶解及TCS的釋放。而當浸泡2d后，這種情況變得更為明顯。這顯示涂層在與模擬體液接觸的條件下逐漸部分溶解，部分TCS可以釋放到溶液中。表面形貌變化與涂層表面及浸泡液中的TCS含量的變化趨勢相當一致。

圖6 TCS釋放不同時間后表面形貌化照片(a)4h；(b)8h；(c)1d；(d)2dFig.6 Morphology after different time of TCS release(a)4h；(b)8h；(c)1d；(d)2d

3.3 PDA-TCS涂層的抗菌性能

不同含量TCS 的涂層的抗菌效應如圖7 所示。棉拭子將金黃色葡萄球菌落均勻涂抹整個瓊脂培養(yǎng)基，并放置一段具有PDA-TCS涂層的縫合線后，一開始菌落均勻地充滿整個培養(yǎng)基，但隨著培養(yǎng)時間的延長，3d后縫合線周圍的菌落消失。這表明制備得到的涂層具有一定的抗菌效果。而且，從圖可見，隨著TCS負載量的提高，縫線周圍抑菌區(qū)域的面積有所增大，這表明抗菌性能的提高。涂層對不同種類的細菌均具有殺滅效果。

結合涂層穩(wěn)定性和TCS釋放實驗結果，這一結果顯示初期能夠穩(wěn)定存在于縫合線表面的涂層及其所含的TCS有效地殺滅了細菌，抑制菌落的形成，從而起到抑制細菌感染的作用。也就是說，制備所得的PDA-TCS涂層的抗菌性能具有一定長效性。這對醫(yī)用縫合線所經(jīng)常面臨的術后初期的細菌感染是非常有益的。而且，其對醫(yī)用縫合線表面特性未做過多改變，特別適用于需要較快降解的醫(yī)用縫合線。

圖7 具有不同含量TCS的涂層的抗菌效應(a1)～(d1)：金黃葡萄球菌；(a2)～(d2)：大腸桿菌；(a1)～(a2)：3g/L；(b1)～(b2)：4g/L；(c1)～(c2)：5g/L；(d1)～(d2)：6g/LFig.7 Anti-bacterial effects of PDA/TCS coatings(a1)～(d1)：S.A.；(a2)～(d2)：E.coli；(a1)～(a2)：3g/L；(b1)～(b2)：4g/L；(c1)～(c2)：5g/L；(d1)～(d2)：6g/L

4 結 論

本研究基于采用PDA 作為TCS的載藥涂層來覆蓋在醫(yī)用縫合線上，并對其進行SEM、XPS、體外釋放和抗菌實驗等一系列測試，研究結果如下：

1.通過多巴胺的自聚合反應可在醫(yī)用縫合線表面有效固載TCS形成PDA-TCS復合薄膜。

2.涂層中TCS的含量可以通過TCS 濃度調(diào)節(jié)，但隨著TCS濃度的增加其含量逐漸飽和。

3.涂層對大腸桿菌和金黃葡萄球菌具有殺滅性能，且浸泡2d后，仍有約25%的TCS 剩余。這顯示涂層能夠滿足縫合線初期抗菌的需要。