凌 敏，楊明晶，梁 婕，陳東亞，張 薇，卞 倩*

（江蘇省疾病預(yù)防控制中心毒理與風(fēng)險評估研究所，江蘇 南京 210009）

納米二氧化鈦（nano-TiO2）因具有較好的光催化活性、抗紫外線、強(qiáng)表面吸附能力和特殊的光電效應(yīng)等特性，已被廣泛應(yīng)用于涂料、纖維、塑料、油漆、精細(xì)陶瓷、化妝品和食品等領(lǐng)域[1-4]。常規(guī)尺度的TiO2被認(rèn)為基本無毒，其已獲得美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)為食品添加劑使用[5]。而由于nano-TiO2粒徑小，因此理化性質(zhì)會表現(xiàn)出不同于常規(guī)粒子的特性，進(jìn)入機(jī)體后能引起不一樣的生物學(xué)效應(yīng)[6]?，F(xiàn)在國內(nèi)外研究越來越關(guān)注nano-TiO2的安全性及潛在毒性。研究發(fā)現(xiàn)nano-TiO2對免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心臟和肝腎等器官及對哺乳動物生殖發(fā)育均產(chǎn)生一定的影響[4-5，7]。因此，對nano-TiO2生物安全性的評估和研究具有重要現(xiàn)實意義。本研究通過擴(kuò)展一代繁殖試驗（OECD 443）觀察nano-TiO2暴露對F1子代大鼠免疫功能的影響，為nano-TiO2的安全性評價提供基礎(chǔ)毒理學(xué)數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品

13周齡SPF級SD大鼠90只，雄性30只，雌性60只，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0011號。實驗在江蘇省疾病預(yù)防控制中心毒理與風(fēng)險評估研究所動物實驗室進(jìn)行。屏障環(huán)境實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0031號。實驗室溫度20～24 °C，濕度40%～70%。實驗期間動物自由飲水、攝食。粒徑為5～30 nm的nano-TiO2購自美國Nanostuctured and Amorphous Materials公司，由國家食品安全風(fēng)險評估中心提供。用滅菌水配置成25 mg/mL的nano-TiO2混懸液，實驗前用超聲處理器進(jìn)行超聲分散。

1.2 主要儀器及試劑

Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國BD），Scientz-II D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新生物科技股份有限公司），ADVIA?2120血細(xì)胞分析儀（德國Siemen），細(xì)胞篩、紅細(xì)胞裂解液、CD3/CD4/CD8大鼠流式檢測抗體、CD3/CD45RA/CD161a大鼠流式檢測抗體（美國BD），1640培養(yǎng)基（美國Gibco），綿羊血紅細(xì)胞（南京森貝伽生物科技有限公司）。

1.3 實驗動物分組及處理

雌、雄大鼠適應(yīng)3 d后分性別按隨機(jī)方法分入各組，對照組和nano-TiO2組均為45只，其中雄性大鼠15只，雌性大鼠30只。nano-TiO2組每天按10 mL/kg灌胃給予25 mg/mL的nano-TiO2混懸液1次，對照組每天灌胃給予等體積生理鹽水。灌胃2周后，同組大鼠按雌∶雄為2∶1比例于晚上合籠，次日早晨進(jìn)行陰栓及陰道涂片檢查。每組保證至少20只孕鼠。各組雌鼠在交配期、妊娠期和哺乳期繼續(xù)灌胃染毒，直至子鼠離乳。雌鼠在子鼠離乳后處死。子鼠從離乳到出生后56 d（PND56）持續(xù)每天灌胃1次染毒。PND56子鼠處死后稱體質(zhì)量，收集肝、脾臟和胸腺，計算臟器系數(shù)[臟器系數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/動物體質(zhì)量（g）×100%]，并進(jìn)行脾和潘氏淋巴結(jié)分型和抗體生成細(xì)胞檢測。

1.4 脾和潘氏結(jié)淋巴細(xì)胞分型檢測

每組隨機(jī)選取10只子鼠，雌雄各半。頸椎脫臼處死后，迅速取脾和小腸潘式淋巴結(jié)后將其放入盛有5 mL 1640培養(yǎng)基的平皿中，用注射器針頭劃碎，然后經(jīng)細(xì)胞篩過濾，300 g離心5 min，棄上清。加入2 mL紅細(xì)胞裂解液裂解5～10 min后，300 g離心5 min，用無菌PBS洗3遍，懸浮于1～2 mL 1640完全培養(yǎng)基中。經(jīng)CD3/CD4/CD8和CD3/CD45RA/CD161a大鼠流式抗體染色后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞分型檢測，得出T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞比例及計算CD4/CD8陽性細(xì)胞比值。

1.5 抗體生成細(xì)胞檢測

用生理鹽水將無菌脫纖維綿羊血細(xì)胞濃度調(diào)整為5×109個/mL，每組隨機(jī)選取10只子鼠，雌雄各半，腹腔注射綿羊血紅細(xì)胞（SRBC）0.4 mL致敏。免疫5 d后，將子鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行溶血空斑試驗。計數(shù)溶血空斑數(shù)，用每百萬個脾細(xì)胞內(nèi)含空斑形成細(xì)胞的平均數(shù)來表示抗體生成細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)用xˉ±s表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗，以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Nano-TiO2對子代大鼠免疫器官臟器系數(shù)的影響

由表1可見，與對照組比較，nano-TiO2組雌鼠脾臟系數(shù)升高，而雄鼠肝臟系數(shù)降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。其余觀察指標(biāo)與對照組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 Nano-TiO2對F1代子鼠免疫器官臟器系數(shù)的影響（x±s，%，n=20）

2.2 Nano-TiO2對子代大鼠脾和潘式結(jié)淋巴細(xì)胞分型的影響

見表2和表3。與對照組相比，nano-TiO2組脾和潘式結(jié)淋巴細(xì)胞分型結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 Nano-TiO2對F1代子鼠脾淋巴細(xì)胞分型和脾抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響±s，n=10）

表2 Nano-TiO2對F1代子鼠脾淋巴細(xì)胞分型和脾抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響±s，n=10）

性別雌性雄性組 別對照組nano-TiO2對照組nano-TiO2 CD4/CD8陽性細(xì)胞比值1.67±0.38 1.69±0.33 1.78±0.32 1.76±0.28 B細(xì)胞比例/%50.27±4.28 47.88±3.18 47.83±5.21 49.06±4.36 T細(xì)胞比例/%31.25±3.22 32.31±2.59 31.32±3.38 27.84±3.84 NK細(xì)胞比例/%10.34±2.43 11.51±1.13 10.55±1.79 10.72±0.91空斑數(shù)203.0±94.6 292.7±164.2 224.9±95.0 249.8±82.7

表3 Nano-TiO2對F1代子鼠潘式結(jié)淋巴細(xì)胞分型的影響s，n=10）

表3 Nano-TiO2對F1代子鼠潘式結(jié)淋巴細(xì)胞分型的影響s，n=10）

性別雌性雄性組 別對照nano-TiO2對照nano-TiO2 CD4/CD8陽性細(xì)胞比值4.18±0.53 3.59±1.37 3.59±1.12 3.45±0.61 B細(xì)胞比例/%47.61±7.61 54.27±8.54 35.32±6.76 33.09±9.64 T細(xì)胞比例/%27.56±3.54 26.18±4.37 26.82±6.82 25.18±6.01 NK細(xì)胞比例/%2.08±0.55 2.05±0.49 2.03±0.58 2.19±0.55

2.3 Nano-TiO2對子代大鼠脾抗體生成細(xì)胞數(shù)的影響

由表2可見，抗體生成細(xì)胞檢測試驗結(jié)果顯示nano-TiO2組子代大鼠溶血空斑數(shù)與對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米材料廣泛應(yīng)用于食品、制藥、電子產(chǎn)品、化妝品、添加劑等領(lǐng)域[8-9]。納米顆粒（1～100 nm）由于其在納米尺度下，會呈現(xiàn)出不同于其分子形式的物理化學(xué)性質(zhì)[10]。納米顆粒進(jìn)入生命體后產(chǎn)生一系列的生物學(xué)效應(yīng)與常規(guī)尺度的物質(zhì)不同，它可通過與生物體的蛋白、核酸分子及細(xì)胞相互作用，而產(chǎn)生生物毒性，如呼吸毒性、生殖毒性、神經(jīng)毒性等[11-13]。近年來，隨著人們接觸納米材料的機(jī)會越來越多，因此其對人體健康及環(huán)境帶來的潛在危害也引起了廣泛的關(guān)注。

免疫系統(tǒng)對于機(jī)體防御病原體的入侵和維持機(jī)體自身的穩(wěn)定狀態(tài)具有非常重要的作用及意義，往往動物在早期或小劑量接觸毒物時，機(jī)體其他系統(tǒng)還未受到損害，免疫系統(tǒng)就會先受到影響[14]。機(jī)體免疫由特異性免疫和非特異性免疫組成。特異性免疫應(yīng)答包括細(xì)胞免疫與體液免疫，T細(xì)胞主要介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫，B細(xì)胞是體液免疫的主要細(xì)胞[15-16]。而T細(xì)胞又分為CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，正常情況下，這兩種細(xì)胞保持在一種平衡狀態(tài)下，CD4/CD8陽性細(xì)胞的比值可直接反映機(jī)體免疫狀況，是維持機(jī)體健康的重要指標(biāo)[17-18]。

Fu等[19]采用氣管滴注nano-TiO2對SD大鼠進(jìn)行染毒，染毒組劑量分別為0.5、4和32 mg/kg，每周2次，連續(xù)28 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2對大鼠免疫細(xì)胞及器官有一定影響，隨著染毒劑量的增加，B淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，但是T細(xì)胞亞群數(shù)量和NK細(xì)胞數(shù)量與對照組相比無顯著差異；病理學(xué)顯示，高劑量組肺泡腔內(nèi)和淋巴結(jié)可見納米棕色顆粒和團(tuán)塊物質(zhì)沉積，脾和胸腺未見異常。Wang等[20]用5 g/kg的nano-TiO2對小鼠進(jìn)行1次灌胃染毒，14 d后觀察發(fā)現(xiàn)nano-TiO2可在脾臟蓄積，但并未發(fā)現(xiàn)脾臟的病理學(xué)改變。Park等[21]用20 mg/kg nano-TiO2對小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃染毒，脾淋巴細(xì)胞分型結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比NK細(xì)胞、B細(xì)胞增加，而T細(xì)胞減少，CD4/CD8陽性細(xì)胞比值下降。Sang等[22]發(fā)現(xiàn)將不同濃度（2.5、5 和 10 mg/kg）nano-TiO2對小鼠持續(xù)灌胃90 d，小鼠外周血內(nèi)CD3+、CD4+、CD8+和B細(xì)胞和NK細(xì)胞量，以及CD4/CD8陽性細(xì)胞比率較對照組降低。這些研究表明不同濃度和作用不同時間的nano-TiO2暴露會攻擊實驗動物的免疫系統(tǒng)，使其受到不同程度的損傷。

由于納米粒子容易自發(fā)凝聚，表現(xiàn)出強(qiáng)烈的團(tuán)聚性，而失去納米粒子所具有的特性。在本實驗室條件下，我們通過超聲分散的方法使nano-TiO2在滅菌水中保持納米特性且穩(wěn)定性在一周內(nèi)保持良好，25 mg/mL為能達(dá)到的最高配制濃度。本研究用25 mg/mL的nano-TiO2混懸液對親代大鼠及子鼠進(jìn)行灌胃染毒（灌胃體積為10 mL/kg），結(jié)果發(fā)現(xiàn)nano-TiO2組F1子代雌鼠脾臟及雄鼠肝臟相對質(zhì)量與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但由于病理學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)異常，且不存在性別一致性，相對質(zhì)量數(shù)據(jù)的變化在本實驗室歷史數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報道范圍內(nèi)，因此認(rèn)為差別無生理學(xué)意義。但機(jī)體免疫功能的改變通常發(fā)生在器質(zhì)性改變之前，因此，我們進(jìn)一步檢測了子代大鼠脾和潘氏結(jié)淋巴細(xì)胞分型。與對照組相比，Nano-TiO2組脾與潘式結(jié)淋巴細(xì)胞分型結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，提示nano-TiO2對子代大鼠B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的穩(wěn)定性無明顯影響。

溶血空斑試驗是一種體外檢測抗體形成細(xì)胞的方法，是國際上一致認(rèn)可檢測體液免疫較為敏感且有效的指標(biāo)，通過計數(shù)抗體形成細(xì)胞的數(shù)量可以反映對小鼠B細(xì)胞活化的能力和抗體生成的能力，從而評價對機(jī)體體液免疫的影響[17，23]。本研究結(jié)果顯示與對照組相比，nano-TiO2組F1子代雌雄大鼠溶血空斑數(shù)均無顯著變化（P＞0.05）。提示在 250 mg/kg 劑量下 nano-TiO2對子代大鼠體液免疫功能無明顯影響。

綜上，本研究通過一代繁殖毒性擴(kuò)展試驗探討nano-TiO2對子代大鼠免疫功能的影響，旨在為nano-TiO2生物安全性的評估提供有益參考，為日后制定相關(guān)nano-TiO2使用規(guī)范的國家標(biāo)準(zhǔn)和納米材料毒性評估提供理論依據(jù)。根據(jù)本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2在250 mg/kg劑量下，未發(fā)現(xiàn)對F1子代大鼠免疫功能產(chǎn)生異常影響。