李 鴿，王耀斐，干 娜，賀 琪，王 冠，韓占鋒，海春旭，藺兆星，*

（1.陜西省地方病防治研究所皮膚性病防治研究室，陜西 西安 710003；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系毒理學(xué)教研室，陜西省自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032）

肝臟有強(qiáng)大的再生能力，肝再生過程很迅速，在臨床上進(jìn)行肝移植后，供體和受體的肝臟一般在術(shù)后都能通過再生恢復(fù)各自的體積[1]。然而，在急性和慢性肝損傷情況下，肝臟的再生能力可受到嚴(yán)重抑制，進(jìn)而導(dǎo)致肝功能衰竭[2-3]。目前治療肝功能衰竭唯一有效的方法是肝移植，但肝移植仍面臨供體來源不足和免疫排斥等諸多問題[4]。因此，研究肝再生的分子機(jī)制對于肝功能衰竭的治療和再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展意義重大。目前認(rèn)為有很多分子和信號通路參與了肝細(xì)胞再生過程[5-7]，但肝再生的機(jī)制仍不完全清楚。自1931年Higgins首先建立了經(jīng)典肝切除（partial hepatectomy，PH）模型后，30%和70%肝切除術(shù)被廣泛地用于研究肝再生[8-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，雖然30%和70%肝切除后肝臟體積都能恢復(fù)，但再生的機(jī)制不同。30%肝切除術(shù)后，肝細(xì)胞體積增加，但不進(jìn)入細(xì)胞周期，增生的肝細(xì)胞足以恢復(fù)肝體積；而在70%肝切除術(shù)后，肝細(xì)胞最初的反應(yīng)是細(xì)胞體積增大，隨后啟動(dòng)細(xì)胞增殖，通過分裂來增加細(xì)胞數(shù)量[4]。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是一大類在分子組成上含有氧但化學(xué)性質(zhì)比氧活潑的物質(zhì)的總稱[10]。ROS除了引起氧化應(yīng)激，還廣泛參與細(xì)胞分化、增殖、免疫等過程[11]。近年文獻(xiàn)報(bào)道ROS還可能是啟動(dòng)肝再生的關(guān)鍵因素[12]。錳超氧化物歧化酶（manganese-dependent superoxide dismutase，MnSOD）是超氧化物歧化酶家族中唯一一個(gè)維持需氧器官生存的必要蛋白，主要負(fù)責(zé)清除線粒體內(nèi)自由基，是保護(hù)組織和細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶。在正常人體中，活性氧的生成主要是作為線粒體內(nèi)電子傳遞鏈的副產(chǎn)品，線粒體基質(zhì)中的MnSOD的作用機(jī)制是催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)，將之轉(zhuǎn)化為過氧化氫和氧，最后過氧化氫在谷胱甘肽過氧化物酶或過氧化物酶家族的作用下降解為水和氧氣。MnSOD可以有效地清除細(xì)胞中的ROS，保護(hù)其免受ROS的損傷[13]。同時(shí)，MnSOD也有調(diào)控細(xì)胞增殖的作用[14-15]。然而，作為ROS和細(xì)胞增殖的調(diào)控分子，MnSOD在肝再生過程中的作用并不十分清楚。因此，本研究以BALB/c小鼠為研究對象，通過比較30%和70%肝切除后MnSOD的表達(dá)和活性變化，初步探究MnSOD在肝再生過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級健康雄性BALB/c小鼠38只，體質(zhì)量18～22 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物飼料由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度為（24±2）℃，相對濕度為（50±10）%，12 h/12 h交替照明和避光。

1.2 主要試劑及儀器

Isoflurane購自RWD瑞沃德公司；RIPA裂解液購自碧云天生物科技有限公司；DTT購自Sigma公司；Western Lumax Light Peroxide購自ZETA公司；Hoechest及DHE染料購自Sigma公司；兔抗鼠tubulin單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；兔抗鼠MnSOD單克隆抗體購自Cell Signaling公司；BCA蛋白定量分析試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；MnSOD活性檢測試劑盒購自Beyotime公司；R510-11 JJsoflurane小動(dòng)物麻醉機(jī)及吸收過濾器，均為RWD瑞沃德公司產(chǎn)品；SCIENTZ-48高通量組織研磨器為Scientz新芝公司產(chǎn)品；Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)、Mini-PROTEAN電泳系統(tǒng)、蛋白半干轉(zhuǎn)裝置、蛋白核酸測定儀（Smartspec Plus）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，均為Bio-Rad公司產(chǎn)品；FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒和SuperReal PreMix Plus試劑盒均購自Tiangen公司；BX51正置熒光顯微鏡及fluoFV10i激光共聚焦顯微鏡，均為Olympus公司產(chǎn)品；全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)為Sigma公司產(chǎn)品；Infinite M200 PRO全波段酶標(biāo)儀為Tecan產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組和處理 將實(shí)驗(yàn)小鼠38只隨機(jī)分為3組：30%肝切除術(shù)組和70%肝切除術(shù)組，每組各18只；同時(shí)對2只小鼠施行假手術(shù)作為對照。假手術(shù)組只打開腹腔并不進(jìn)行肝切除；肝切除術(shù)組行肝切除術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)，由于小鼠在肝切除術(shù)后肝細(xì)胞迅速增殖，并在1周內(nèi)逐漸恢復(fù)，因此分別于肝切除后術(shù)后6 h和1、2、3、5、7 d處死小鼠。

1.3.2 動(dòng)物造模 小鼠置于小動(dòng)物麻醉機(jī)中使用異氟烷吸入麻醉，各組小鼠參考Higgins和Aderson的大鼠肝切除模型施行肝部分（30%和70%）手術(shù)切除，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)對手術(shù)方法進(jìn)行改良。小鼠麻醉后開始備皮，酒精消毒，取上中腹切口，逐層入腹，用手輕輕將小鼠肝左側(cè)葉擠出，輕輕提起，小心離斷肝臟周圍韌帶，4-0線置于肝蒂根部并結(jié)扎肝蒂，然后切除肝臟左側(cè)葉，剪斷線頭，此過程為30%肝切除術(shù)。用手輕輕將小鼠肝左側(cè)葉擠出，再緩慢將肝臟中葉旋出，小心離斷肝臟周圍韌帶，4-0線置于肝蒂根部并結(jié)扎肝蒂，然后切除肝臟左側(cè)葉及肝臟中葉，剪斷線頭，此過程為70%肝切除術(shù)。檢查有無活動(dòng)性出血，全層連續(xù)縫合切口，手術(shù)結(jié)束。

1.3.3 動(dòng)物處死 在異氟烷麻醉?xiàng)l件下處死動(dòng)物，迅速摘取小鼠肝組織，保存于-80℃冰箱中。

1.3.4 肝組織活性氧水平檢測 制備厚度為10μm的新鮮肝組織冰凍切片，向肝組織滴加含10μmol/L DHE及10μmol/L Hoechst染料的PBS 500μL，將切片置于濕盒中，在37℃避光條件下孵育20 min，孵育完畢使用預(yù)冷的PBS洗3次后吸干水分，甘油封片，迅速于激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果、采集圖像后使用Viewer軟件進(jìn)行定量分析。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測MnSOD mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑盒抽提小鼠肝組織總RNA，用核酸定量儀測定RNA濃度和260 nm/280 nm處的吸光度比值D（260）/D（280）。初步確定總RNA的濃度及純度，比值在1.6～1.8之間時(shí)可用于反轉(zhuǎn)錄。然后用DNase I去除總RNA中的基因組DNA。將RNA稀釋10倍后按照快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒FastQuant RT Kit（With gDNase）操作程序反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。按照設(shè)定的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，檢測各組織中MnSOD mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀設(shè)置聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）程序如下：變性（95 ℃、15 min）；延伸（95 ℃、10 s，57 ℃、20 s，72 ℃、32 s）；退火（72 ℃、10 min）。循環(huán)44次。應(yīng)用比較CT法進(jìn)行相對定量。Real time PCR總反應(yīng)體系（20μL）為：cDNA模板1 μL，2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，上游引物（10 μmol/L）和下游引物（10 μmol/L）各 0.6 μL，RNase-Free ddH2O 7.8μL，同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對照，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用生物凝膠層析100（RAD）進(jìn)行掃描，并用定量軟件進(jìn)行分析。所用引物的序列為：MnSOD，正向5'-GGC ACCTTTCTCAGTAGCGG-3'，反向5'-CTAAGGGACC CAGACCCAAC-3'；β-actin，正向 5'-ATCATGTTTG AGACCTTCAACA-3'，反向 5'-CATCTCTTGATCGAA GTCCA-3'。引物序列由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.3.6 MnSOD蛋白含量檢測 肝組織經(jīng)過相應(yīng)處理后，采用Western blot檢測相關(guān)蛋白水平。具體過程：取少量蛋白用BCA蛋白定量試劑盒，測定蛋白濃度，以總上樣量為20～30μg計(jì)算上樣體積。蛋白樣品與等量2×上樣Buffer混勻后煮沸5 min，冷卻后離心混勻。根據(jù)不同相對分子質(zhì)量，采用濃度分別為7%、10%及12%的濃縮膠，按計(jì)算好的體積上樣后，150 V電泳60 min。用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，棄封閉液，TBST洗膜后加入相應(yīng)的一抗溶液，4℃搖床孵育過夜。用TBST洗膜3次，5 min/次。5%脫脂牛奶稀釋相應(yīng)的辣根酶二抗，室溫孵育2 h，TBST洗4次，5 min/次。發(fā)光液均勻覆蓋膜后，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，并使用Quantity One軟件對條帶成像進(jìn)行定量分析。

1.3.7 MnSOD酶活力檢測 以預(yù)冷的生理鹽水為勻漿介質(zhì)（肝組織100 mg：生理鹽水0.9 mL）在冰上機(jī)械勻漿后于高通量組織研磨器自動(dòng)勻漿，勻漿液在4℃、4 000 r/min，離心10 min，取上清。稀釋樣品后進(jìn)行BCA蛋白定量從而確定蛋白需要量，分別加入抑制劑A和抑制劑B。采用碧云天生物科技有限公司生產(chǎn)的CuZn/MnSOD活性檢測試劑盒（WST法）配制WST-8/酶工作液和啟動(dòng)液，嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說明書操作，檢測肝勻漿中MnSOD酶活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，各實(shí)驗(yàn)組間的比較使用單因素方差分析（Oneway ANOVA），各實(shí)驗(yàn)組與對照組之間的比較使用Dunnett’s t檢驗(yàn)，以α=0.05為檢測水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肝切除后小鼠肝組織ROS水平的變化

檢測30%和70%肝切除后不同時(shí)間的ROS水平，使用Viewer軟件定量分析后發(fā)現(xiàn)，兩組肝切除模型的ROS變化不同。見圖1。30%肝切除模型中，相比假手術(shù)對照組，在6 h后ROS水平顯著升高（P＜0.05），1 d后開始下降（P＜0.05），第2～7天恢復(fù)至對照組水平（P均＞0.05）；在70%肝切除后6 h無明顯變化，第1天開始ROS顯著增加，一直持續(xù)至第5天（P均＜0.05），第7天ROS水平降低，與對照組間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 肝切除后小鼠肝組織MnSOD mRNA水平的比較

檢測30%和70%肝切除后MnSOD mRNA水平發(fā)現(xiàn)，兩者變化趨勢相反。30%肝切除術(shù)后第6小時(shí)和第1天MnSOD mRNA含量顯著增加（P均＜0.05），而第2天降至對照組水平，第3天和第5天又逐漸增加（P均＜0.05），在第7天恢復(fù)至對照組水平。70%肝切除后MnSOD mRNA的水平逐漸降低，第2天降至最低值（P均＜0.05），第3天開始增加，但仍低于對照組（P＜0.05），至第5天和第7天增至對照組水平。見圖2。

圖1 30%和70%肝切除后小鼠肝組織中活性氧的變化

圖2 30%和70%肝切除后小鼠肝組織中MnSOD mRNA的變化

2.3 肝切除后小鼠肝組織MnSOD蛋白表達(dá)水平

用Western blot法檢測MnSOD蛋白的含量發(fā)現(xiàn)，在30%肝切除組中，與對照組相比，肝切除后各時(shí)間點(diǎn)MnSOD的蛋白含量均未發(fā)生明顯變化（P均＞0.05）；而MnSOD水平在70%肝切除組中變化明顯，相比假手術(shù)對照組，術(shù)后第6小時(shí)其含量變化不明顯（P均＞0.05），第1～3天逐漸下降，在第3天降到最低值，第5天開始增加（P均＜0.05），于第7天恢復(fù)至對照組水平。見圖3。

圖3 30%和70%肝切除后小鼠肝組織中MnSOD蛋白水平的變化

2.4 肝切除后小鼠肝組織MnSOD的酶活力比較

30%和70%肝切除后MnSOD的酶活力變化不完全一致，前者在術(shù)后第1天酶活力增強(qiáng)，達(dá)到最高值，第2～3天下降，第3天降至最低，并低于對照組活力，第5天酶活力開始恢復(fù)（P均＜0.05），第7天增加至對照組水平（P＞0.05）；而后者在術(shù)后第6小時(shí)增至最高，第1～5天酶活力逐漸下降（第3天已低于對照組），第7天開始增加，但仍低于對照組水平（P均＜0.05）。見圖4。

圖4 30%和70%肝切除后小鼠肝組織中MnSOD酶活力的變化

3 討論

正常生理狀態(tài)下絕大部分肝細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，但在受到感染、中毒或部分肝切除后，肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并進(jìn)行復(fù)制，表現(xiàn)出強(qiáng)大的再生能力和功能代償能力。然而，多種有害因素（病毒、藥物和酒精等）不僅引起大量肝細(xì)胞損傷壞死，而且還嚴(yán)重?fù)p傷肝臟的再生潛能，進(jìn)而導(dǎo)致肝功能衰竭[9]。臨床上重型肝炎肝衰竭患者、肝硬化或者肝癌行肝切除手術(shù)者，肝臟再生能力的強(qiáng)弱對于患者的預(yù)后具有重要意義[16]。研究發(fā)現(xiàn)，肝再生涉及炎癥、再生等多個(gè)生理病理過程[6，17]，70%肝切除可引起包含30%肝切除后導(dǎo)致的基因改變[18]，而相比較而言70%肝切除后的肝再生過程變化更為顯著，因?yàn)閱?dòng)細(xì)胞增殖與分裂完成肝再生的是70%肝切除[4]，我們前期研究提示MnSOD可能在肝再生中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，本研究通過同時(shí)建立30%和70%肝切除模型，比較了兩種模型中MnSOD的表達(dá)變化，初步探究了MnSOD在肝再生過程中的作用。

肝切除后誘發(fā)的較高劑量的ROS在肝再生過程中起著重要的開關(guān)作用[12]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)30%和70%肝切除后ROS均明顯增加，但兩者增加的模式并不相同。30%肝切除后ROS增加迅速，第6小時(shí)增加顯著，持續(xù)時(shí)間短，第2天已降至正常水平。而70%肝切除后ROS增加相對滯后，第1天開始增加，但持續(xù)時(shí)間相對較長，第1～5天均維持高ROS狀態(tài)。以上結(jié)果提示30%肝切除后ROS的增加可能只是一過性應(yīng)激反應(yīng)，而70%肝切除后持續(xù)增加的ROS可能是肝再生所必需的條件。有文獻(xiàn)報(bào)道，在70%肝部分切除術(shù)后的12 h或更晚，染色質(zhì)的早期重塑可能通過改變基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)細(xì)胞增殖與分裂[18]。我們在30%和70%肝切除模型中檢測了MnSOD轉(zhuǎn)錄水平的變化，結(jié)果顯示30%肝切除早期MnSOD轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，第2天恢復(fù)正常水平，這與ROS的變化類似，提示這可能是ROS誘發(fā)的細(xì)胞抗氧化反應(yīng)，而在第3天和第5天出現(xiàn)的第二個(gè)轉(zhuǎn)錄增加的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。早期文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，處于靜息狀態(tài)下的細(xì)胞中MnSOD的水平要比處于增殖狀態(tài)高[19]，而下調(diào)MnSOD的水平可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。MnSOD起著分子開關(guān)作用，可以啟動(dòng)靜息細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期[15]。我們發(fā)現(xiàn)70%肝切除后MnSOD轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)下降，這說明MnSOD水平的下調(diào)很有可能參與了肝再生過程。

雖然30%肝切除后MnSOD轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)兩個(gè)增加時(shí)段，但蛋白水平的檢測發(fā)現(xiàn)MnSOD的含量未發(fā)生明顯變化，這可能與非編碼RNA（non-coding RNA）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。70%肝切除MnSOD的含量下降，與轉(zhuǎn)錄變化基本一致，進(jìn)一步提示MnSOD可能調(diào)控了肝再生過程。MnSOD作為細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化酶，我們對其酶活性進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)30%肝切除后MnSOD活性第1天增強(qiáng)，這可能是ROS升高誘發(fā)的防御性反應(yīng)，第2天ROS水平正常后，其活性開始下降，在第3天MnSOD活性降至最低后逐漸恢復(fù)正常。雖然70%肝切除術(shù)后第6小時(shí)MnSOD活性也增強(qiáng)，但之后持續(xù)下降，第7天仍未恢復(fù)正常活性。過高水平的ROS可能導(dǎo)致肝細(xì)胞的氧化損傷，因此MnSOD活性的升高清除了部分ROS，而之后MnSOD活性的下調(diào)可以使ROS保持在促增殖作用的較高劑量，最終啟動(dòng)細(xì)胞分裂。MnSOD蛋白和活性的改變不盡一致可能是因?yàn)榇嬖诜g后修飾的現(xiàn)象。Sarsour等[20]在靜息狀態(tài)下可發(fā)生MnSOD蛋白第89位賴氨酸的甲基化，這種修飾可以顯著增強(qiáng)MnSOD的活性，而在增殖狀態(tài)下發(fā)生的去甲基化使酶活性降低。因此，在有些情況下MnSOD的蛋白水平并未發(fā)生變化，但活性可發(fā)生很大的改變[15]。

綜上所述，我們通過比較30%和70%肝切除后MnSOD表達(dá)和活性變化，初步揭示了MnSOD在肝再生過程中的負(fù)調(diào)控作用，其機(jī)制可能與下調(diào)表達(dá)的MnSOD含量和活性進(jìn)而導(dǎo)致ROS升高有關(guān)。本研究為闡明肝再生的分子機(jī)制提供了線索，為臨床上治療肝功能衰竭提供了研究思路和潛在靶點(diǎn)。