楊美娜 閔寒毅

健康的眼表對于正常視功能的維持至關重要。在結構上，眼表與眼瞼皮膚相延續(xù)，由結膜，角膜，鞏膜和淚膜組成，通過與其他成分（如免疫細胞、激素、小分子物質及微生物群落等）相互作用，形成眼表微環(huán)境。正常的眼表微環(huán)境對于眼表健康是關鍵的。大多數(shù)人的眼表存在著相對穩(wěn)定的微生物群落[1]。眼表微生物群落包括真菌、細菌及病毒等微生物種類，但數(shù)量最多且最重要的是細菌[2]。菌群受自身營養(yǎng)代謝和宿主免疫屏障等因素作用，形成穩(wěn)定的共生狀態(tài)，正常情況下并不致病，即結膜囊的正常菌群。機體免疫力下降時，部分定植細菌異常增殖，引起眼部感染，稱之為條件致病菌。

1 眼表細菌菌群的取樣、培養(yǎng)、鑒定方法

1.1 取樣

目前大多數(shù)研究采用的方法是以拭子于結膜囊取樣。該類方法陽性率高，而又以濕棉拭子取樣培養(yǎng)陽性率最高。其他眼表標本取樣方式包括淚液拭子、結膜印跡試紙、瞼緣拭子、脫落睫毛等[3]。

1.2 培養(yǎng)及鑒定

傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)和鑒定方法依賴于實驗室培養(yǎng)和細菌的形態(tài)學特征。其結果受培養(yǎng)相關因素影響，包括采樣方法、培養(yǎng)基類型（包括“血瓊脂”和“巧克力瓊脂”）、大氣條件（需氧，微需氧和厭氧）、溫度、濕度和培養(yǎng)時間[4]。而新型鑒定方法，如16S rRNA 測序，不受理化因素的限制，檢出率更高。其他方法還包括宏觀基因組測序（更常用于分析微生物代謝和功能途徑）、計算機模擬核型分析、PCR、變性梯度凝膠電泳（DGGE）和焦磷酸測序。

傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)鑒定受各種理化因素影響較大，且依賴于細菌的形態(tài)生物學，檢出陽性率較低，而以16S rDNA/16S rRNA 高通量測序為代表的分子生物學鑒定方法，具有高靈敏度和特異性，能夠全面、精確地鑒定眼表細菌菌群的種屬組成。

16S rDNA 存在于細菌染色體基因組，具有保守性、普遍存在性及特征性，被作為微生物檢測和分類鑒定的一種強有力的分子指標。因16S rDNA 檢測為非培養(yǎng)性分析技術，故結果不受抗生素使用的干擾，并適用于鑒定死菌和尚無法培養(yǎng)的細菌。但16S rRNA 高通量測序對設備條件和實驗成本較傳統(tǒng)的表型鑒定高，故成本是目前限制其推廣的關鍵因素。

2 眼表細菌菌群的分布情況

回顧國內大樣本研究，國內基于傳統(tǒng)培養(yǎng)及分離鑒定方法的報道基本一致：正常結膜囊菌群主要包括凝同酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌和鏈球菌，其中表皮葡萄球菌是最常見的眼表菌株。孫旭光等[5]對1 411 份結膜囊標本進行培養(yǎng)，陽性率為35.9%。由高至低分別為凝固酶陰性葡萄球菌（表皮葡萄球菌為主，36.2%）、棒狀桿菌（16.8%）、微球菌屬（12.5%）、金黃色葡萄球菌（10.7%）。王娟等[6]對25 728 名受試者進行結膜囊細菌培養(yǎng),檢出率最高的3 種細菌分別為表皮葡萄球菌（71.47%)、鏈球菌屬細菌（11.78%)和金黃色葡萄球菌（7.43%)。對1992—2004 年國內正常人結膜囊細菌培養(yǎng)進行Meta 分析顯示陽性率最高的依次為表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、微球菌及類白喉桿菌[7]。國外文獻報道和國內的研究結果基本一致，健康眼表最常見的細菌是凝固酶陰性金黃色葡萄球菌（包括表皮葡萄球菌），其次為丙酸桿菌屬、棒狀桿菌屬、金黃色葡萄球菌屬、鏈球菌屬和微球菌屬[2]。基于16S rDNA 基因高通量測序得到健康人眼表細菌種屬的結果與傳統(tǒng)的一致[8-9]。有學者提出眼表核心菌群的概念，認為假單胞菌（20%），丙酸桿菌（20%），根瘤菌（16%），棒狀桿菌（15%），不動桿菌（12%），短波單胞菌（5%），葡萄球菌（4%），水桿菌（2%），鞘氨醇單胞菌（1%）和鏈球菌（1%）等常見的12 個屬眼部微生物群為眼表核心微生物群[2]。

3 眼表細菌菌群的影響因素

3.1 年齡及性別

國內外的研究均支持年齡影響結膜囊?guī)Ь鸂顩r，其中10 歲以下及60 歲以上者結膜囊細菌陽性率較高[6，10]。老年組陽性率高，可能與免疫功能減退，淚膜穩(wěn)定性差，淚液分泌減少、淚液成分（抗體、補體、乳鐵蛋白、溶菌酶等）缺乏致眼表的防御性功能降低有關[11]。1 歲以上兒童最常見為表皮葡萄球菌[12]，可能與過敏性結膜炎、倒睫等刺激導致的不良生活習慣（比如喜揉眼）有關。新生兒結膜囊分泌物培養(yǎng)陽性率差異較大，菌株多樣，可能受新生兒免疫功能低下及分娩方式影響。

盡管已有證據(jù)證明結膜囊細菌受性別影響[13-14]，但尚無定論。國內有報道稱男性結膜囊細菌陽性率普遍高于女性[6，15]，而國外的文獻報道更傾向于兩者之間沒有明顯差異[10，16]。

3.2 季節(jié)

季節(jié)主要表現(xiàn)為溫度及濕度的改變，而兩者為影響微生物群落演進的重要因素。結膜囊溫度和濕度相對穩(wěn)定，但受環(huán)境溫度與濕度影響[17]，并可能影響結膜囊菌群。國外學者從人口水平，分別以“腋臭、腳氣及胃腸脹氣”三個明確與微生物群落有關的癥狀及疾病為關鍵詞，統(tǒng)計網(wǎng)絡上相關關鍵詞的頻率變化，顯示該類其檢索頻次呈季節(jié)性變化，間接說明季節(jié)對人體微生物群落的影響[18]。國內學者證明結膜囊?guī)Ь闆r隨季節(jié)變化[19-20]，春季（70.5%）及夏季（67.7%）結膜囊細菌培養(yǎng)陽性率較高，而秋季（42.8%）與冬季（40.4%）較低，差別顯著，但各季節(jié)培養(yǎng)的細菌種類均以凝固酶陰性的葡萄球菌為主，多為表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌（占60.19%）[20]。

3.3 生活習慣

生活習慣對眼表菌群的影響的熱點主要集中于角膜接觸鏡的使用。目前的研究更傾向于佩戴角膜接觸鏡導致眼表菌群的改變，并認為其與眼表感染相關。Sankaridurg 等[21]發(fā)現(xiàn)佩戴軟性角膜接觸鏡與病原菌的定植，尤其是革蘭氏陰性菌如粘質沙雷氏菌和流感嗜血桿菌顯著相關。與非鏡片佩戴組相比，佩戴組的干燥結膜拭子檢測結果差異更大，接近于皮膚細菌群落結構；其甲基桿菌、乳酸桿菌、不動桿菌和假單胞菌豐度更高，而嗜血桿菌、鏈球菌、葡萄球菌和棒狀桿菌豐度更低[22]。連續(xù)一年佩戴軟性角膜接觸鏡者結膜囊菌群豐度較對照組高[23]，而檢出的菌群類型無明顯差異。

3.4 是否伴發(fā)其他疾病

3.4.1 干眼癥 淚液在眼表分布形成淚膜，起潤滑作用，同時含有抗菌物質，如溶菌酶、乳鐵蛋白、免疫球蛋白A（IgA）、載脂蛋白和補體等，具有免疫防御作用。干眼癥患者的淚液因質和量的改變，導致局部的防御機制減退，因此影響淚膜穩(wěn)定性的因素可能導致眼表菌群改變。Graham 等[8]比較正常和干眼患者眼表菌群，發(fā)現(xiàn)正常組常規(guī)細菌培養(yǎng)的陽性率為75%，干眼組為97%，凝固酶陰性葡萄球菌（表皮葡萄球菌為主）是最常分離的細菌；而16S rDNA 測序提示干眼組細菌總體水平較正常組高，但主要菌群一致。而在與干眼癥密切相關的MGD 組（meibomian gland dysfunction）發(fā)現(xiàn)結膜囊細菌的陽性率及種類均較正常組高，且與干眼嚴重程度呈正相關，分離出的主要菌株均為葡萄球菌，棒狀桿菌和微桿菌科[24]。

3.4.2 瞼緣炎 高瑞等[25]對101 例瞼緣炎患者與85 例健康者做細菌培養(yǎng)陽性的菌株鑒定發(fā)現(xiàn)，瞼緣炎組眼表帶菌量高于健康者，但葡萄球菌屬的陽性率低于正常對照組。朱越峰等[26]報道與健康者相比，瞼緣炎組結膜囊細菌培養(yǎng)陽性率較高，以表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌及棒狀桿菌為主。Lee 等[27]對瞼緣炎患者和健康者的眼表樣本進行DNA 測序分析，發(fā)現(xiàn)瞼緣炎組眼表含有更多的鏈霉菌、棒狀桿菌和棲水菌，而葡萄球菌，鏈霉菌，棒狀桿菌，棲水菌和丙酸桿菌均較正常減少。

3.4.3 白內障 國內外研究表明[28]，白內障患者結膜囊?guī)Ь示哂诮】嫡撸饕隇楸砥て咸亚蚓徒瘘S色葡萄球菌。程瑩瑩等[29]對2004 年1 月—2013 年9 月發(fā)表的國內白內障術前結膜囊細菌培養(yǎng)的文獻進行Meta 分析發(fā)現(xiàn)白內障術前結膜囊培養(yǎng)陽性率為26.03%，以表皮葡萄球菌（67.30%）、金黃色葡萄球菌（12.53%）和微球菌（6.98%）為主。但白內障患者多為老年人，需排除年齡因素的影響。

3.4.4 糖尿病 國外一項較大規(guī)?；仡櫺匝芯匡@示[30]，糖尿病患者結膜囊檢出率最高者為金黃色葡萄球菌和克雷伯氏菌，且腸球菌和α-溶血鏈球菌的檢出率增加。國內文獻報道糖尿病組和對照組結膜囊細菌主要為革蘭氏陽性菌，其中表皮葡萄球菌和丙酸痤瘡桿菌檢出率最高[31]。有文獻報道糖尿病患者結膜囊細菌檢出率及種類與對照組無明顯差異，與糖尿病病程以及類型無直接的關系[32-33]。但有學者提出[34]，糖尿病患者中各菌門的檢出率與對照組無明顯差異，但在糖尿病組中變形菌更為豐富，其不動桿菌含量更高。因此糖尿病患者眼表菌群特征尚待進一步研究。

4 結論

傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法容易受各種理化因素影響，細菌檢測陽性率低、穩(wěn)定性差。新一代測序和生物信息學方法（如16SrRNA測序）鑒定的眼表微生物群陽性率高。國內外不同研究者研究結果進行比較，健康人眼表細菌培養(yǎng)陽性率、細菌種屬、分布存在有差異，但前三位始終是凝固酶陰性的表皮葡萄球菌、棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌。在干眼癥患者和瞼緣炎患者中，結膜囊細菌的陽性檢出率均較正常高，前者葡萄球菌呈增多趨勢，而后者呈減少趨勢。角膜接觸鏡的佩戴，可能導致眼表微生物菌群的改變，增加眼表感染的機會。眼表微生物組的持續(xù)研究對于我們了解眼表微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，以及其在眼科疾病中的作用十分必要，為我們預防和治療眼病提供了新思路。