石福岳，容維中，高 博，徐建峰，王燕燕，董 和，張艷麗

（1.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，平?jīng)?744000；2.平?jīng)鍪修r(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心，甘肅 平?jīng)?744000）

鈣蛋白酶（Calpain）是一種廣泛存在于大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的半胱氨酸蛋白酶，通過(guò)對(duì)細(xì)胞骨架蛋白、磷酸酶和蛋白激酶的作用，參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖與分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等［1］。鈣蛋白酶主要位于骨骼肌中的肌纖維Z盤(pán)附近和肌質(zhì)間膜上，分為p94、m-calpain和μ-calpain三種［2］。μ-calpain 又被稱(chēng)為CAPN1，可以被微摩爾級(jí)濃度的Ca2+激活。CAPN1 包含一個(gè)80 kD 的大亞基和一個(gè)30 kD 的小亞基，參與動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)，且在宰后通過(guò)引起肌肉中肌原纖維的水解導(dǎo)致動(dòng)物肌肉的嫩化［3］。CAPN1基因作為影響肌肉嫩度的候選基因，其生理調(diào)控功能和分子生物學(xué)特性是近年來(lái)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一［4］。Page 等［5］通過(guò)直接測(cè)序的方法對(duì)牛群體CAPN1基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了研究，在第9 外顯子和第14 外顯子各檢測(cè)到一個(gè)錯(cuò)義突變，即外顯子9 的G/C 之間的顛換，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)多肽鏈中第316 位氨基酸由甘氨酸變?yōu)楸彼?，外顯子14 的A/G 之間的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致第530 位氨基酸有異亮氨酸和纈氨酸兩種可能性。田璐等［6］采用PCR-RFLP 法檢測(cè)中國(guó)西門(mén)塔爾牛CAPN1基因SNPs 位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果表明，CAPN1316 位點(diǎn)和CAPN14 751 位點(diǎn)分別發(fā)生C/G 顛換和C/T 轉(zhuǎn)換，且兩位點(diǎn)與牛肉大理石花紋以及剪切力相關(guān)。

早勝牛是隴東地區(qū)長(zhǎng)期自然選育形成的優(yōu)良地方類(lèi)群，其體質(zhì)結(jié)實(shí)、體驅(qū)緊湊、骨骼較粗、肌肉豐滿、肉用性能好，已成為隴東地區(qū)養(yǎng)殖的主導(dǎo)肉牛群體。但是由于近年來(lái)盲目引種，造成牛種混雜，生產(chǎn)性能不穩(wěn)定或下降，尤其是一些固有特性及優(yōu)勢(shì)基因逐漸流失，對(duì)其保護(hù)和利用形成了較大威脅。本研究通過(guò)DNA 池測(cè)序法檢測(cè)早勝牛CAPN1基因22 個(gè)外顯子的SNPs 位點(diǎn)，分析其多態(tài)性以及遺傳多樣性，為下一步分析其與早勝牛肉質(zhì)的相關(guān)性打下基礎(chǔ)，也為采用分子育種方法提高早勝牛肉用性能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)早勝牛血樣采自慶陽(yáng)市寧縣的早勝牛養(yǎng)殖場(chǎng)或?qū)I(yè)合作社，共采集血樣320 份，加抗凝劑搖勻后，置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及DNA 混合池的構(gòu)建 基因組DNA使用OMEGA 全血DNA 提取試劑盒提取，TE 緩沖液溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度，并用分光光度計(jì)NanoDrop2000 測(cè)定濃度和OD260/OD280，將DNA 樣品稀釋至100 ng/μL。每個(gè)樣本取5 μL，每10 個(gè)樣本構(gòu)成一個(gè)混合池，再以混合池為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增 參考GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中牛的CAPN1基因序列（登錄號(hào)：AH009246），使用軟件Primer 5 及Oligo 6 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，對(duì)早勝牛CAPN1基因的22 個(gè)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增，引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 早勝牛CAPN1 基因引物信息

以DNA 混合池為模版進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol）、DNA 模版1 μL（100 ng），ddH2O 9.5μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性35 s，退火30 s，72℃延伸30 min，32 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，選取條帶清晰、特異性良好的PCR 產(chǎn)物委托北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

將測(cè)序得到的DNA 序列用DNAStar 軟件中的SeqMan、Editseq 等程序進(jìn)行拼接，排列同源序列并進(jìn)行人工校正，用DNAStar 軟件中MegAlign 進(jìn)行序列比對(duì)，以便分析其SNPs 位點(diǎn)。利用測(cè)序圖看圖軟件Chromas和MWSnap 測(cè)量各SNP 位點(diǎn)等位基因峰高，根據(jù)以下公式估算等位基因頻率［7］。

式中f i表示SNP 位點(diǎn)某等位基因頻率，h1和h2分別表示測(cè)序圖上該SNP 等位基因1、2 峰高度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取結(jié)果

采用試劑盒法提取的血液DNA，用核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)濃度和純度，其OD260/OD280在1.8～2.0 之間。 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后結(jié)果如圖1，結(jié)果顯示，所提取的DNA 濃度較高，無(wú)雜帶及拖尾現(xiàn)象。表明提取的DNA純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 血液DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以DNA 混合池為模版，用15 對(duì)引物分別對(duì)早勝牛CAPN1基因外顯子進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（如圖2），由圖2 可以看出，各引物擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，且特異性較好，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致。

圖2 PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.3 序列分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar 軟件的分析和比對(duì)，結(jié)果只有引物CA3、CA5、CA8、CA12、CA13 和CA14 的擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)到堿基突變（測(cè)序峰如圖3）。CA3 引物擴(kuò)增產(chǎn)物包括Exon5 和Exon6，在Exon5 的3 717 bp 處檢測(cè)到一個(gè)G/A 突變，該突變?yōu)橥x突變。在Exon6 的3 854 bp處檢測(cè)到A/G 突變，導(dǎo)致異亮氨酸/纈氨酸突變。CA5引物擴(kuò)增產(chǎn)物包括部分Exon8、全部Exon9 和部分Exon10，其中在Exon9 的5 709 bp 處檢測(cè)到C/G 顛換，并引起丙氨酸/甘氨酸突變。CA8 引物擴(kuò)增產(chǎn)物為部分Exon13 和全部的Exon14，其中Exon14 的11 058 位點(diǎn)發(fā)生G/A 突變，該堿基突變引起氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?。CA12 擴(kuò)增產(chǎn)物包括Exon21 和部分Exon22，其中，在Exon22 的15 299 bp 處發(fā)生G/A 突變，但該突變?yōu)橥x突變，未引起氨基酸的改變。CA13引物擴(kuò)增產(chǎn)物包括部分Exon22，其中在15 682 處發(fā)生G/C 顛換，引起半胱氨酸/絲氨酸的突變。CA14 引物擴(kuò)增產(chǎn)物為Exon10，與參考序列相比在6 004 bp 處發(fā)生C/T 突變，并導(dǎo)致所編碼氨基酸由精氨酸突變?yōu)榻K止密碼子。

圖3 測(cè)序峰圖

2.4 等位基因頻率估算

利用MWSnap 軟件的標(biāo)尺分別測(cè)量7 個(gè)SNPs 等位基因峰高，根據(jù)公式估算各SNPs 位點(diǎn)的等位基因頻率，結(jié)果見(jiàn)表2。如表2 所示，SNPs 位點(diǎn)C5709G 和C6004T 的突變型等位基因的頻率均大于野生型等位基因的頻率，而其余SNPs 位點(diǎn)的野生型等位基因頻率均大于突變型等位基因的頻率。

表2 各SNPs 位點(diǎn)等位基因頻率估算結(jié)果

3 討論

鈣蛋白酶是一種廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞中的蛋白水解酶。大量的研究表明，CAPN 參與了肌肉中肌原纖維的水解過(guò)程，因此也直接參與了肌肉生長(zhǎng)和畜禽屠宰后嫩化的過(guò)程。Smith 等［8］將影響豬肉嫩度性狀的QTL位點(diǎn)定位在該基因上。長(zhǎng)期以來(lái)，CAPN1基因的遺傳變異及其對(duì)牛肉嫩度效應(yīng)的相關(guān)研究較多。曹陽(yáng)等［9］對(duì)草原紅牛CAPN1基因第5 外顯子進(jìn)行SNPs 分析后，發(fā)現(xiàn)其第5 外顯子存在A3717G 突變，突變后的多態(tài)導(dǎo)致牛肉剪切力值及肌纖維直徑等肉質(zhì)性狀呈現(xiàn)不同程度的差異，表明該位點(diǎn)可能是CAPN1基因上一個(gè)重要的SNP 位點(diǎn)。武秀香等［10］采用PCR-SSCP 方法對(duì)中國(guó)黃牛不同群體中的CAPN1基因的遺傳變異進(jìn)行了研究，結(jié)果檢測(cè)到A4558G 和C4684T 兩個(gè)突變位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)對(duì)牛肉嫩度和大理石花紋有顯著效應(yīng)，且A4558G 和C4684T 位點(diǎn)對(duì)肉嫩度的影響具有累加作用。張彩霞等［11］、陳曉杰［12］在不同類(lèi)群牛CAPN1基因第9 外顯子處分別檢測(cè)到G458C、G5709C 突變，且G為優(yōu)勢(shì)等位基因。姜成國(guó)等［13］對(duì)草原紅牛、延邊黃牛CAPN1基因第14 內(nèi)含子區(qū)4 685 位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性與肉質(zhì)嫩度分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)存在C/T 突變，且該變異與肉嫩度、眼肌面積存在一定程度的相關(guān)性。

本研究采用DNA 混合池測(cè)序法對(duì)早勝牛CAPN1基因22 個(gè)外顯子的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了研究，結(jié)果共檢測(cè)到7 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，包括G3717A、A3854G、C5709G、C6004T、G11058A、G15299A 和G15682A。其中，G3717A位于第5 外顯子，但不會(huì)導(dǎo)致氨基酸的改變，屬同義突變。這一結(jié)果與姜成國(guó)等［13］的研究結(jié)果一致。A3854G位于第6 外顯子，導(dǎo)致氨基酸由異亮氨酸變?yōu)槔i氨酸。C5709G 突變位于第9 外顯子，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生丙氨酸/甘氨酸突變，此結(jié)果與Page 等［5］、田璐等［6］、張彩霞等［10］、陳曉杰［11］等的研究結(jié)果一致。C6004T 突變位于第10 外顯子處，這一堿基突變引起氨基酸由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程的終止，從而影響基因的表達(dá)過(guò)程。C5709G 和C6004T 兩個(gè)SNPs 位點(diǎn)的突變等位基因頻率高于突變前等位基因頻率，其對(duì)早勝牛肉質(zhì)性狀等的影響還需要進(jìn)一步研究。G11058A位于第14 外顯子，并引起纈氨酸/異亮氨酸的突變，這一結(jié)果與Page 等［5］的研究結(jié)果一致。G15299A、G15682A位于第22 外顯子，G15299A 為同義突變，未引起氨基酸的改變，而G15682A 突變引起氨基酸發(fā)生半胱氨酸/絲氨酸的突變。A3854G、C6004T、G15299A、G15682A 這4 個(gè)突變位點(diǎn)為本研究首次發(fā)現(xiàn)。今后還需對(duì)其擴(kuò)大樣本量或采取其他研究方法進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性進(jìn)行深入分析。

本研究主要針對(duì)CAPN1基因的全部外顯子，對(duì)其內(nèi)含子、5’-UTR 和3’-UTR 等區(qū)域尚未進(jìn)行研究，今后將對(duì)這些區(qū)域多態(tài)性進(jìn)行進(jìn)一步的研究，并對(duì)其與肉質(zhì)性狀、胴體性狀以及肌肉纖維等性狀的相關(guān)性進(jìn)行分析。

4 小結(jié)

本研究對(duì)早勝牛CAPN1基因的全部外顯子多態(tài)性進(jìn)行了分析，共檢測(cè)到7 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中3 個(gè)位點(diǎn)與前人的研究結(jié)果一致，且已有研究表明這些遺傳變異與肉質(zhì)嫩度、大理石花紋等性狀相關(guān)，表明其可能作為肉品質(zhì)相關(guān)候選基因的作用。其余4 個(gè)為本研究首次發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)，今后將對(duì)這些多態(tài)位點(diǎn)與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步的研究分析。