李雪賢，李 敏，張瑞濤，陳 述，吳帥帥，劉 冰，于 杰

（國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東 東阿 252200）

德州驢，原產(chǎn)于魯北平原沿渤海一帶，我國傳統(tǒng)的役肉兼用驢品種，也是中國五大優(yōu)良驢種之一［1-2］。隨著農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展和消費(fèi)者不斷增加的對驢皮、驢肉、驢奶的需求［2-3］，人工繁殖技術(shù)在提高動物養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益方面發(fā)揮著越來越重要的作用。該技術(shù)在牛、羊上的應(yīng)用較為普遍，但在驢上的應(yīng)用目前大多是模仿馬進(jìn)行操作［4-5］。相關(guān)領(lǐng)域的研究也多集中在精液的冷凍保存技術(shù)方面［6-7］，而對種公驢采精過程中影響因素的研究相對較少。已有的研究表明，多種因素影響人工采精過程中種公畜的精液量和品質(zhì)，而最重要的影響因素則是精液的采集頻率［8］。采集頻率過高，種公畜疲勞，爬跨無力，精液質(zhì)量下降，導(dǎo)致過早淘汰［9］；采集頻率過低，則浪費(fèi)種公畜資源，增加養(yǎng)殖成本。因此，確定符合種公驢實(shí)際情況的采精頻率，既能保證獲得優(yōu)質(zhì)的精液以增加母驢的受胎率，又能提高種公驢的利用率，對實(shí)際生產(chǎn)有著重要意義。據(jù)此，本試驗(yàn)在常規(guī)飼養(yǎng)管理條件下，通過研究不同采精頻率對成年種公驢精液質(zhì)量的影響，確定最適宜的采精頻率，為實(shí)際生產(chǎn)中種公驢的合理使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及飼養(yǎng)管理

對東阿國家黑毛驢繁育中心34 頭種公驢2018 年3—7 月的采精狀況及生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行跟蹤與統(tǒng)計。種公驢的飼養(yǎng)管理按照繁育中心飼養(yǎng)管理技術(shù)規(guī)程進(jìn)行，采用自由飲水、自由采食、“先粗后精”的飼喂方式，給予自然光照和良好的圈舍環(huán)境，種公驢至少“空采”兩輪后開始記錄數(shù)據(jù)［10］。

1.2 試驗(yàn)材料

假陰道，集精杯，恒溫水浴鍋，顯微鏡，載玻片，蓋玻片，精液密度測定儀，商用稀釋液，程序冷凍儀，精液數(shù)位分析系統(tǒng)，等等。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

將34 頭種公驢的生產(chǎn)數(shù)據(jù)按采精頻率分為4 組：A 組（每3 天采精1 次）、B 組（每4 天采精1 次）、C 組（每5 天采精1 次）和D 組（每10 天采精1 次）。本研究共收集并整理種公驢140 d 的采精數(shù)據(jù)，剔除前兩次“空采”數(shù)據(jù)后，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.4 精液樣品的采集、測定指標(biāo)及測定方法

使用消毒后的假陰道刺激法進(jìn)行精液采集，收集精液至集精杯中，稱量體積，記錄射精量。顯微鏡下觀察精子狀態(tài)并使用精液數(shù)位分析系統(tǒng)測量原精的精子活力，記錄快速向前運(yùn)動精子數(shù)。使用精液密度測定儀檢測原精中精子密度。向原精液中按1∶1 的比例加入商用稀釋液，按1 850 r/min 離心10 min，去掉上清液。用精液凍存液重懸精子［7］，使用細(xì)管灌裝打印機(jī)分裝精液至0.5 mL 凍精細(xì)管中，4℃冷藏柜中平衡2～3 h，使用全自動冷凍儀快速冷凍精子，并投入液氮長期保存。每批冷凍樣品均進(jìn)行解凍復(fù)檢，檢測精子解凍活力，計算凍精成品率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用SPSS 20.0 軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）以及鄧肯（Duncan）多重比較對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)分析。當(dāng)P<0.05 時，認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采精頻率對種公驢精液量的影響

如圖1 所示，隨著采精周期的延長和采精頻率的下降，種公驢采集到的精液量逐漸減少。A 組與B 組種公驢總精液量間無顯著性差異（P>0.05），但與C 組（P<0.05）和D 組間差異顯著（P<0.05）。C 組的總精液量顯著低于A 組（P<0.05）和B 組（P<0.05），但顯著高于D 組（P<0.05）。

圖1 不同采精頻率下種公驢的總精液量

2.2 不同采精頻率對種公驢精子密度的影響

如圖2 所示，種公驢精液中精子密度隨著采精頻率的下降而增加。A 組和B 組種公驢精液中精子密度間并無顯著性差異（P>0.05），但二者均顯著低于C 組（P<0.05）和D 組（P<0.05）；而C 組和D 組的精子密度間差異不顯著（P>0.05）。

圖2 不同采精頻率下種公驢精液中的精子密度

2.3 不同采精頻率對種公驢精子活力的影響

由表1 可知，種公驢精子活力隨著采精間隔的增加呈現(xiàn)下降趨勢。A 組、B 組和C 組的原精精子活力間并不存在顯著性差異（P>0.05），但均顯著高于D 組（P<0.05）；而經(jīng)過冷凍再解凍后的精子活力也呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律。

表1 采精頻率對種公驢精子活力的影響

2.4 不同采精頻率對種公驢精子冷凍復(fù)蘇率的影響

如圖3 所示，隨著采精周期的延長和采精頻率的下降，種公驢精子冷凍后再復(fù)蘇的合格率逐漸下降。A 組精子的冷凍復(fù)蘇率超過80%，且顯著高于其他各組（P<0.05）；而采精間隔時間延長后的B 組和C 組復(fù)蘇率隨之下降，但二者之間并無顯著性差異（P>0.05）；D 組精液冷凍復(fù)蘇率急劇下降，與A 組相比下降了近50%。

圖3 不同采精頻率下種公驢精子的冷凍復(fù)蘇率

2.5 采精頻率與種公驢精液各指標(biāo)之間的相關(guān)性

由表2 可知，種公驢的采精頻率與精子的凍后活力（r=-0.389）和復(fù)蘇率（r=-0.338）之間均呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)（P<0.05）。此外，原精活力與精子密度之間（r=0.382）存在顯著的正相關(guān)（P<0.05），總精液量與精子密度之間（r=-0.568）、凍后活力與復(fù)蘇率之間（r=0.775）均存在極顯著的相關(guān)性（P<0.01）。

表2 采精頻率與精液各指標(biāo)之間的相關(guān)性以及精液各指標(biāo)之間的相關(guān)性

3 討論

采精頻率對畜禽繁殖性能的影響已在許多動物上得到證明。以往的研究發(fā)現(xiàn)，采精過于頻繁，種畜得不到休息，精子可能受到類似于體細(xì)胞凋亡的生化損害，導(dǎo)致精液品質(zhì)降低，影響母畜受胎率；而采精間隔時間過長，儲存在附睪中的精子會隨時間解體、死亡，導(dǎo)致其不宜使用［11］。因此，研究采精頻率對種公畜精液各指標(biāo)的影響就顯得至關(guān)重要。

人們普遍認(rèn)為，精液體積和精子濃度會隨著射精間隔時間的延長而增加，但同時也會對精子的活力產(chǎn)生負(fù)面影響［12］。Noirault 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)增加精液采集頻率首先會增加種禽射精量，但對精子濃度并無顯著影響。但Nwachukwu 等［14］曾報道，精子濃度會隨著精液采集頻率的增加而減少。Savic'等［15］在成年種公豬上的研究結(jié)果表明，采精間隔3～5 d，可以獲得射精量和精子密度的最佳平衡。本研究中，種公驢雖然在每3 天采精1 次和每4 天采精1 次的采精頻率下，精液總體積變化并不顯著（P＞0.05），但隨著采精間隔時間的延長，總精液量逐漸減少，尤其當(dāng)采精頻率延長至每10天采精1 次后，精液量急劇下降。與此同時，原精液中的精子密度隨采精頻率下降而顯著增加（P<0.05），最終穩(wěn)定在一定范圍內(nèi)。將種公驢總精液量和精子密度進(jìn)行相關(guān)性分析可知，二者呈極顯著的負(fù)相關(guān)（P<0.01）。Mosenene［16］報道，精子密度是受射精頻率影響的最顯著指標(biāo)，且隨著射精頻率的增加而逐漸下降，這與本研究結(jié)果相一致。在本研究中，并未發(fā)現(xiàn)采精頻率與精子密度存在顯著的相關(guān)性，可能是由于本研究的采精頻率依然較低，未能對密度產(chǎn)生明顯的影響。

已有的研究證明，精子的活力一定程度上受其在睪丸內(nèi)儲存時間的影響［17］。如Savic'［15］的研究表明，3～5 d的采精間隔時間，對精子活力無顯著影響（P＞0.05），但采精間隔時間超過7 d 以上時，種公豬精液品質(zhì)降低，尤其是精子活力急劇下降，嚴(yán)重影響生產(chǎn)力，從而增加了生產(chǎn)成本［18］。本研究中，當(dāng)采精頻率為每3 天1 次、每4 天1 次和每5 天1 次時，種公驢的原精活力與冷凍精子的解凍活力略有下降，但不存在顯著差異（P>0.05），而當(dāng)采精頻率延長為每10 天采精1 次時，二者均顯著降低（P<0.05）。根據(jù)以往的研究，該結(jié)果可能是由于精子在附睪中儲存時間過長，在活性物質(zhì)如活性氧、活性氮和過氧化氫等的作用下，發(fā)生過氧化反應(yīng)，造成精子膜完整性喪失，DNA 受損，最終導(dǎo)致精子質(zhì)量下降［17，19］。本試驗(yàn)的統(tǒng)計結(jié)果顯示，精子的復(fù)蘇率與其凍后活力具有極顯著的相關(guān)性（P<0.01），原因是其只有在解凍后活力達(dá)到0.35 以上時，才被認(rèn)為是可以使用的合格精子。而采精頻率對種公驢精子冷凍復(fù)蘇率會產(chǎn)生顯著的影響（P<0.05），且隨著采精間隔時間的延長，精子冷凍復(fù)蘇率明顯下降，特別是當(dāng)采精頻率下降為每10天采精1 次時，比每3 天采精1 次的復(fù)蘇率下降50%。

4 結(jié)論

①種公驢的采精頻率與總精液量和原精活力之間存在負(fù)相關(guān)趨勢，而與凍后活力和復(fù)蘇率之間均呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)（P<0.05）。因此，合理安排種公驢的采精頻率，可以獲得穩(wěn)定的精液質(zhì)量。②從精液量方面分析，最佳采精頻率為每4 天采精1 次；從精子密度方面分析，最佳采精頻率為每5 天采精1 次；而從原精活力、凍后活力及復(fù)蘇率3 方面考慮，則最佳采精頻率為每3 天采精1 次。綜合以上各項指標(biāo)，認(rèn)為種公驢最適宜的采精頻率為每3 天采精1 次。