宋莉莎，司世飛，龍友華，，劉仁祥，李 忠，

(1.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州大學(xué) 貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

煙草赤星病是一種發(fā)生于煙葉成熟中后期的重要病害，具有潛育期短、流行速度快的特點(diǎn)，可直接影響煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量。赤星病的病原菌為鏈格孢菌(Alternariaalternata)，屬半知菌亞門(mén)鏈格孢屬[1]。目前，赤星病的防治方法包括選育抗病品種、化學(xué)藥劑防治、生物防治、農(nóng)業(yè)措施防治等多種。在眾多防治方法中，生物防治對(duì)煙草生產(chǎn)的可持續(xù)性發(fā)展具有極大的意義，也是近年來(lái)科技工作者研究較多和最具發(fā)展?jié)摿Φ囊环N防治方法，受到國(guó)內(nèi)外的普遍關(guān)注。生物防治利用有益微生物對(duì)植物病原菌的不良影響，使病原菌致病性減弱、數(shù)量減少，從而達(dá)到病害防治的效果[2]，其不污染環(huán)境、不產(chǎn)生抗藥性、對(duì)人無(wú)毒害[3]，符合人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的要求。在病害的生物防治中，生防細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物均發(fā)揮了十分重要的作用[4]。其中，生防芽孢桿菌(Bacillusspp.)不僅耐高溫、紫外線、酸堿，具較強(qiáng)抗逆性，且具有殺菌高效、防治效果佳、安全性評(píng)價(jià)高、可誘導(dǎo)抗病性、促生增產(chǎn)、便于制劑化、成本較低等優(yōu)點(diǎn)[5]，是科研和生產(chǎn)中應(yīng)用較多的生防細(xì)菌[6]?；诖耍鶕?jù)菌株對(duì)煙草赤星病菌的抑菌效果，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法和雙層平板打孔法從貴州省甕安縣植煙土壤中分離篩選生防芽孢桿菌，并對(duì)其進(jìn)行分類鑒定，初步探討生防菌的生長(zhǎng)條件，為煙草赤星病的生物防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試病原菌

煙草赤星病菌WN1菌株，由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離、保存。

1.2 培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL。

NB培養(yǎng)液：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、蒸餾水1 000 mL。

PDB培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖1 g、酵母提取物2.5 g、胰蛋白胨5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酵母粉10 g、NaCl 1 g、K2HPO40.1 g、MgSO40.05 g、蒸餾水1 000 mL。

氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、NaCl 1 g、K2HPO40.1 g、MgSO40.05 g、蒸餾水1 000 mL。

上述培養(yǎng)基pH值均為7.0～7.2。

1.3 土壤細(xì)菌的分離、純化、保藏

從貴州省甕安縣煙草種植基地植煙土壤中隨機(jī)采集土樣，帶回實(shí)驗(yàn)室烘干備用。稱取10 g土樣于裝有90 mL無(wú)菌水的錐形瓶中，在搖床中充分振蕩20 min，采用稀釋涂布平板法將稀釋至10-6和10-72個(gè)濃度的菌液涂布于NA平板上，置于35 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d，對(duì)平板上形態(tài)特征有差異的細(xì)菌進(jìn)行轉(zhuǎn)接純化，保存于NA試管斜面上。

1.4 拮抗細(xì)菌的篩選

初篩：采取平板對(duì)峙培養(yǎng)法篩選，以抑菌帶的大小為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出抑菌帶較大的菌株。

復(fù)篩：采用雙層平板打孔法，對(duì)初篩中抑菌帶較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩，方法參照祝學(xué)海等[7]稍作改良。其中，測(cè)試菌發(fā)酵上清液的制備方法為：在100 mL NB培養(yǎng)液中接種測(cè)試菌的2～3個(gè)單菌落，置于33 ℃、120 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)12 h后，于12 000 r/min 離心2 min，取規(guī)格為0.22 μm的濾頭分批次過(guò)濾上清液，留濾液備用。

1.5 拮抗細(xì)菌的分類鑒定

1.5.1 形態(tài)及生理生化鑒定 將篩選出的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察及生理生化測(cè)試，方法參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[8]、《芽孢桿菌屬》[9]，其中生理生化測(cè)試指標(biāo)包括：V-P測(cè)定、丙酸鹽利用、厭氧生長(zhǎng)、接觸酶、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、甲基紅、明膠液化、淀粉水解、氧化酶等。

1.5.2 分子鑒定 采用改良的CTAB法提取拮抗菌的DNA。首先根據(jù)細(xì)菌16S rDNA序列的特性及其保守序列擴(kuò)增拮抗菌的16S rDNA，正向引物和反向引物分別為BSF(27F)和BSR(1492R)，采用1.0%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)[10]。進(jìn)一步擴(kuò)增gyrA基因，采用引物為gyrA-F和gyrA-R[11]。對(duì)基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序(上海生工生物工程技術(shù)有限公司)，將所測(cè)得的序列進(jìn)行拼接并提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。采取MP法，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件PAUP*4.0b10[12]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.6 拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)條件測(cè)定

1.6.1 菌懸液的制備 在NA平板上活化生防菌，然后接種2環(huán)活化菌于100 mL NB培養(yǎng)液中，在35 ℃恒溫下持續(xù)振蕩(150 r/min) 36 h制作生防菌液。取生防菌液1 mL，通過(guò)濃度梯度稀釋法配制10-5、10-6、10-7、10-84個(gè)濃度的菌液，用平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)平板上細(xì)菌菌落數(shù)(每個(gè)濃度3次重復(fù))，計(jì)算母液濃度，并將母液濃度用無(wú)菌水稀釋到108cfu/mL。

1.6.2 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 取0.5 mL濃度為108cfu/mL的菌懸液接種到100 mL滅菌的NB培養(yǎng)液中，于35 ℃下恒溫振蕩(150 r/min)培養(yǎng)。接種后的前24 h，每隔2 h用分光光度計(jì)在625 nm波長(zhǎng)下測(cè)其OD值，24 h后每隔12 h測(cè)一次。以接0.5 mL無(wú)菌水的NB培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.6.3 溫度對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 取0.1 mL濃度為108cfu/mL的菌液接種到50 mL(三角瓶250 mL)的滅菌NB培養(yǎng)液(pH值7.0)中，然后分別置于0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃的恒溫?fù)u床振蕩 (150 r/min) 培養(yǎng)，48 h后用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)625 nm下測(cè)其OD值。以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)溫度3次重復(fù)。

1.6.4 pH值對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 將滅菌后的NB培養(yǎng)液按每瓶30 mL裝于三角瓶(100 mL)中，將pH值分別調(diào)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0。然后接種0.1 mL濃度為108cfu/mL的菌液于不同pH值的NB培養(yǎng)液中，35 ℃恒溫振蕩(150 r/min)培養(yǎng)，48 h后用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)625 nm下測(cè)其OD值。以不接菌的培養(yǎng)液為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.6.5 碳源對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 碳源種類為甘露醇、麥芽糖、木糖醇、葡萄糖和可溶性淀粉等，以1%的量分別加到碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(20 mL)中并滅菌。取10 μL濃度為108cfu/mL的菌液于各處理培養(yǎng)基內(nèi)，35 ℃下振蕩(150 r/min)培養(yǎng)，以不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，48 h后觀察并在625 nm處測(cè)定菌體的OD值。

1.6.6 氮源對(duì)拮抗細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 氮源種類為蛋白胨、草酸銨、牛肉膏、酵母浸膏和尿素等，以1%的量分別加到氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基(20 mL)中并滅菌。取10 μL濃度為108cfu/mL的菌液于各處理培養(yǎng)基內(nèi)，35℃下振蕩(150 r/min)培養(yǎng)，以不接菌的培養(yǎng)基為對(duì)照，48 h后觀察并在625 nm處測(cè)定菌體的OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌的篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法初步篩出8株可抑制煙草赤星病菌生長(zhǎng)的菌株，再用雙層平板打孔法進(jìn)行復(fù)篩，從中篩選出4株可明顯抑制煙草赤星病菌生長(zhǎng)的菌株，其中抑菌活性最強(qiáng)的菌株為F11，其無(wú)菌發(fā)酵上清液對(duì)病菌生長(zhǎng)的抑菌帶可達(dá)23.5 mm(圖1)。

A、B.平板對(duì)峙培養(yǎng)法(A.病原菌對(duì)照；B.F11菌株+病原菌)；C.雙層平板打孔法 A，B.Plate duel culture method(A.pathogen；B.F11+pathogen)；C.Double plate punching method圖1 生防菌F11對(duì)煙草赤星病菌的拮抗作用Fig.1 The inhibitory effects of the biocontrol strain F11 on A.alternata

2.2 拮抗細(xì)菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)鑒定 菌株F11在NA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的單個(gè)菌落較小，近圓形，中心突起，稍透明，白色，菌落邊緣較整齊。光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體呈短桿狀，為革蘭氏陽(yáng)性菌，可產(chǎn)生橢圓形的芽孢(圖2)。

2.2.2 生理生化鑒定 如表1所示，菌株F11為需氧菌，V-P測(cè)定、淀粉水解、明膠液化、硝酸鹽還原、接觸酶、甲基紅、檸檬酸鹽利用等生理生化試驗(yàn)呈陽(yáng)性，丙酸鹽利用、氧化酶反應(yīng)呈陰性，菌株可在2%、4%的NaCl培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，不可在6%、9%的NaCl培養(yǎng)液中生長(zhǎng)。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，初步鑒定菌株F11為芽孢桿菌屬細(xì)菌。

圖2 生防菌F11菌落形態(tài)特征(A)、革蘭氏染色(B)及芽孢染色(C)Fig.2 The colony morphology characteristics(A),Gram stain(B) and spore stain(C)of the biocontrol strain F11表1 生防菌F11的生理生化特性測(cè)定結(jié)果Tab.1 The physiological and biochemical determination results of the biocontrol strain F11

序號(hào)Number項(xiàng)目Items 特征Characteristics1V-P+2丙酸鹽利用 -3淀粉水解 +4硝酸鹽還原 +5厭氧生長(zhǎng)-6接觸酶+7檸檬酸鹽利用 +8甲基紅 +9明膠液化+10氧化酶 -112% NaCl+124% NaCl+136% NaCl-149% NaCl-

注：+.陽(yáng)性反應(yīng)；-.陰性反應(yīng)。

Note: +.Positive reaction;-.Negative reaction.

2.2.3 16S rDNA及gyrA基因序列分析 擴(kuò)增F11菌株的16S rDNA序列，測(cè)序后在NCBI中用BLAST程序比對(duì)，結(jié)果表明，F(xiàn)11的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬有99%的同源性。進(jìn)一步測(cè)定F11菌株的gyrA基因序列，并與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)11的gyrA基因序列與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)Y37菌株的同源性達(dá)99%。將16S rDNA和gyrA基因序列拼接，采取MP法，用系統(tǒng)發(fā)育分析軟件PAUP*4.0b10構(gòu)建聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3所示，F(xiàn)11菌株與甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌Y37分支距離最近。將F11菌株的16S rDNA和gyrA基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)分別是KY992872、MK120110。

結(jié)合菌株培養(yǎng)特征、生理生化特性及16S rDNA與gyrA聯(lián)合基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株F11鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌。

圖3 生防菌F11基于16S rDNA與 gyrA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of the biocontrol strain F11 based on 16S rDNA and gyrA gene sequences

2.3 拮抗細(xì)菌的生長(zhǎng)條件測(cè)定

2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖4所示，F(xiàn)11菌株接種到NB培養(yǎng)液10 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14～16 h為對(duì)數(shù)期末期，18 h后處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量趨于穩(wěn)定?？梢?jiàn)，該菌生長(zhǎng)速度較快，接種18 h后菌體吸光值達(dá)到最大。

2.3.2 溫度對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖5所示，溫度對(duì)F11菌株的生長(zhǎng)影響較大，當(dāng)溫度在5～35 ℃，F(xiàn)11菌量隨著溫度的升高而增加，以35 ℃為最適生長(zhǎng)溫度。隨著溫度繼續(xù)升高，菌量急劇下降，50 ℃幾乎停止生長(zhǎng)。

2.3.3 pH值對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖6所示，pH值對(duì)F11菌株生長(zhǎng)有明顯的影響，pH值3.5～10.0內(nèi)菌株均能生長(zhǎng)，其中pH值為3.5～6.0時(shí)，菌量隨著pH值升高而增加。菌株生長(zhǎng)較適宜的pH值范圍為4.5～8.0，最適pH值為6.0。

圖4 菌株F11的生長(zhǎng)曲線Fig.4 The growth curve of F11 strain

圖5 溫度對(duì)F11菌株生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effect of temperature on the growth of F11 strain

圖6 pH值對(duì)F11菌株生長(zhǎng)的影響Fig.6 The effect of pH value on the growth of F11 strain

2.3.4 碳源、氮源對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響 如圖7所示，F(xiàn)11菌株對(duì)葡萄糖、木糖醇、甘露醇、可溶性淀粉和麥芽糖均能利用，其中以葡萄糖的利用率最高，菌液吸光值為0.803，其次是麥芽糖。

如圖8所示，F(xiàn)11菌株能夠利用蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、草酸銨和尿素作為生長(zhǎng)氮源，其中蛋白胨的利用率最高，其次是草酸銨和酵母浸膏。

不同字母表示在0.05水平下差異顯著，下同 Different letters indicate significant difference at 0.05 level,the same below圖7 碳源對(duì)F11菌株生長(zhǎng)的影響Fig.7 The effect of carbon source on the growth of F11 strain

圖8 氮源對(duì)F11菌株生長(zhǎng)的影響Fig.8 The effect of nitrogen source on the growth of F11 strain

3 結(jié)論與討論

拮抗細(xì)菌在植物病害的生物防治中扮演著非常重要的角色。與其他生防細(xì)菌相比，芽孢桿菌除了具有出色的生防潛力，還可產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工和菌種在環(huán)境中存活、定殖及繁殖，是植物病害生防微生物的重要組成部分[13-15]。

本試驗(yàn)從植煙土壤中分離篩選的F11菌株，對(duì)煙草赤星病菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。通過(guò)菌株形態(tài)觀察及生理生化測(cè)試，結(jié)合16S rDNA及gyrA基因序列比對(duì)，將該菌株鑒定為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌。目前有關(guān)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的研究報(bào)道不多。甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌是MADHAIYAN等[16]2010年報(bào)道的新種。研究表明，該類菌株對(duì)香蕉枯萎病菌、煙草黑脛病菌、水稻稻瘟病菌、番茄枯萎病菌等均具有較強(qiáng)的抑菌活性[17-21]。胡江春等[22]研究發(fā)現(xiàn)，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌9912經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)植物真菌類病害病原菌具有較強(qiáng)的抑菌作用，同時(shí)其也可作為植物根際促生菌(PGPR)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，有望成為新型的生物殺菌劑。對(duì)F11菌株生長(zhǎng)條件的研究表明，該菌株生長(zhǎng)速度較快，在接種18 h以后進(jìn)入穩(wěn)定期，適應(yīng)的溫度和pH值范圍較廣，生長(zhǎng)的最適溫度是35 ℃，最適pH值為6.0，并可以利用多種碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)。菌株生長(zhǎng)的適宜條件與貴州煙區(qū)煙草赤星病發(fā)病環(huán)境條件相近，因此，菌株F11具有應(yīng)用于煙草赤星病生物防治的潛力。

目前對(duì)甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌作為生防菌的研究報(bào)道較少，還未見(jiàn)該類菌在煙草赤星病防治方面的研究報(bào)道。本試驗(yàn)僅對(duì)F11菌株的分類地位及基本的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，有關(guān)其作用機(jī)制及田間應(yīng)用等，有待進(jìn)一步研究與探討。