馮文心，袁志怡，常忠義，高紅亮，賈彩鳳

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海200241)

γ－多聚谷氨酸(Poly－γ－glutamic acid，γ－PGA)是由L－谷氨酸、D－谷氨酸兩種構(gòu)型的單體，通過γ－酰胺鍵聚合形成的細(xì)胞外水溶性的高分子氨基酸聚合物［1］。γ－PGA具有極佳的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結(jié)性、保濕性和可生物降解等理化和生物學(xué)特性，無毒無害，對人體無任何副作用［2－3］，在醫(yī)藥、食品、塑料以及其它很多方面具有廣闊的應(yīng)用前景［4－5］。

提高γ－PGA的產(chǎn)量一直是實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。數(shù)十年來，人們通過菌種誘變、培養(yǎng)基條件優(yōu)化、生產(chǎn)工藝條件優(yōu)化等手段提高γ－PGA的生產(chǎn)效率［6－9］。然而在 γ－PGA 發(fā)酵過程中，微生物大量繁殖，對氧氣需求量增大，同時伴隨著γ－PGA的大量合成，黏度的急劇增加嚴(yán)重阻礙了氧氣的傳遞，較低的溶氧水平是限制γ－PGA產(chǎn)量提高的一個關(guān)鍵因素。因此，提高發(fā)酵過程中的溶氧是優(yōu)化γ－PGA發(fā)酵中重要的一步。氧載體是指不溶于培養(yǎng)基但能夠吸附或包裹溶解氧，以減少氣液傳氧阻力，提高氧氣傳質(zhì)速率的物質(zhì)，氧氣在其中的溶解度是在水中的15～20 倍［10－11］。近年來，在發(fā)酵體系中添加氧載體越來越受到人們的重視。研究表明，利用氧載體對氧氣高溶解度的特性，將它們添加到發(fā)酵液中，可以降低氧氣的傳質(zhì)阻力，顯著提高了黃原膠、那他霉素、恩拉霉素的產(chǎn)率［12－14］。另外，在發(fā)酵液中添加過氧化氫用來增加發(fā)酵液的溶氧，從而提高了 γ－PGA 的產(chǎn)量［15］，但關(guān)于 γ－PGA 發(fā)酵過程中添加氧載體的研究還鮮有報道。

本文以實驗室篩選的枯草芽孢桿菌為材料，從氧載體種類、加入量和加入時間三個方面進(jìn)行研究，篩選出最優(yōu)的氧載體加入方式，為實現(xiàn)γ－PGA大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 本實驗室分離并保存的枯草芽孢桿菌;氧載體 正己烷、正庚烷為分析純 國藥集團(tuán);正十二烷、正十六烷為分析純 北京沃凱生物科技有限公司;γ－PGA Sigma公司;種子培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L、蒸餾水 1 L，pH7.0;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖 50 g/L、L－谷氨酸鈉50 g/L、酵母粉 10 g/L、NaCl 10 g/L、KH2PO45 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、蒸餾水 1 L，pH7.0。

Sigma 2－16KL冷凍離心機(jī)、QUintix型電子天平(精密度0.1 mg) 塞多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;ZQZY－BF型全溫恒溫培養(yǎng)搖床 上海知楚儀器有限公司;721型分光光度計 上海光學(xué)儀器廠;GNP－9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實驗設(shè)配有限公司;Synergh－HT酶標(biāo)儀 基因有限公司;Brookfield粘度計 Brookfield公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 參考文獻(xiàn)［16］，將斜面菌種接入5 mL種子培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min搖床培養(yǎng)16 h;然后將培養(yǎng)好的種子液以5%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，37℃、250 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.2 添加氧載體的單因素實驗

1.2.2.1 氧載體種類對γ－PGA發(fā)酵的影響 發(fā)酵開始0 h時，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.5%(與培養(yǎng)基的體積比)的正庚烷、正己烷、正十二烷和正十六烷，對照組不添加氧載體(添加的氧載體量很少，帶來的培養(yǎng)基體積變化忽略不計)，發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵液中的γ－PGA產(chǎn)量、菌體生物量(OD600)、發(fā)酵液的粘度，綜合這些指標(biāo)，篩選出可以促進(jìn)γ－PGA產(chǎn)量的氧載體種類。

1.2.2.2 氧載體添加濃度對γ－PGA發(fā)酵的影響 在得到最適氧載體種類的基礎(chǔ)上，發(fā)酵開始0 h時，分別在培養(yǎng)基中以體積比0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%的添加量加入該氧載體，發(fā)酵結(jié)束后，綜合發(fā)酵液中的γ－PGA產(chǎn)量、菌體生物量(OD600)和發(fā)酵液的粘度，確定氧載體的最佳添加濃度。

1.2.2.3 氧載體添加時間對γ－PGA發(fā)酵的影響 在得到最適氧載體種類和最佳添加量的基礎(chǔ)上，分別在發(fā)酵開始0、12、24、36 h時將最適氧載體以最佳添加濃度的加入培養(yǎng)基，發(fā)酵結(jié)束后，綜合發(fā)酵液中的γ－PGA產(chǎn)量、菌體生物量(OD600)和發(fā)酵液的粘度，確定氧載體的最佳添加時間。

1.2.2.4 最優(yōu)氧載體添加方案下γ－PGA搖瓶發(fā)酵曲線 在得到最適氧載體種類與其添加方案后，以該方案進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液每隔6 h取樣，測定γ－PGA產(chǎn)量、菌體生物量(OD600)、發(fā)酵液殘?zhí)呛俊?/p>

1.2.3 指標(biāo)的測定

1.2.3.1 發(fā)酵液中γ－PGA產(chǎn)量的測定 首先制作γ－PGA標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照 Aboy等［17］方法進(jìn)行測定，步驟如下:在0.2 g/L的NaOH溶液中，加入CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，配制成5 g/L的CTAB溶液。制備30、50、60、70、90 μg/mL 的 γ－PGA 標(biāo)準(zhǔn)液，分別取100μL不同濃度的γ－PGA標(biāo)準(zhǔn)溶液和100μL CTAB溶液加入96孔板中，其中以不含γ－PGA的蒸餾水作為對照，37℃反應(yīng)5 min，在酶標(biāo)儀上測定各孔400 nm處吸光度。根據(jù)γ－PGA濃度和OD400吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

發(fā)酵液中γ－PGA產(chǎn)量的測定:取3.0 mL發(fā)酵液，加入9.0 mL預(yù)冷無水乙醇，后置于4℃冰箱過夜12 h，10000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀用30 mL的蒸餾水充分溶解，再次10000 r/min離心10 min，上清即為待測液，其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出發(fā)酵液中的發(fā)酵液中γ－PGA產(chǎn)量。

1.2.3.2 生物量的測定 取3.0 mL發(fā)酵液，用6 mol/L H2SO4調(diào) pH 為3.0，10000 r/min離心10 min，棄上清，菌體沉淀用蒸餾洗滌2次，后將菌體重懸于適量的蒸餾水，測定OD600的吸光值。

1.2.3.3 發(fā)酵液粘度的測定 發(fā)酵結(jié)束后，取50 mL發(fā)酵液用粘度計測量，轉(zhuǎn)子為S64型。

1.2.3.4 發(fā)酵液中殘?zhí)堑臏y定 取1 mL發(fā)酵液，用蒸餾水稀釋10倍，10000 r/min離心去除菌體，用DNS法［18］測定發(fā)酵液中殘?zhí)堑暮俊?/p>

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復(fù)3次，以珚X±SD表示，采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，采用Graphpad Prism 5和Origin Graph作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ－PGA標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

由不同濃度的γ－PGA標(biāo)準(zhǔn)品與反應(yīng)液的OD400吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。該曲線R2達(dá)到了0.99以上，表明γ－PGA濃度與OD400的相關(guān)性良好，可用于測定發(fā)酵液中的γ－PGA濃度。

圖1 γ－PGA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve ofγ－PGA

2.2 氧載體種類對γ－PGA發(fā)酵的影響

由圖2A可知，添加正十六烷的實驗組的γ－PGA產(chǎn)量顯著高于添加正己烷、正庚烷、正十二烷與對照組(p＜0.05)，達(dá)到了 18.43 mg/mL，比對照組13.91 mg/mL相比，增加了32%。在對聚谷賴氨酸合成酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與動力學(xué)研究中指出，胞內(nèi)ATP水平是 γ－PGA 合成代謝的關(guān)鍵調(diào)控因素［18－20］。正十六烷作為氧載體，具有比水較高的溶氧量且與發(fā)酵液不相溶，可以減少氣－液兩相之間的傳氧阻力，提高發(fā)酵液的溶氧能力，發(fā)酵液中溶氧水平的提高，會促進(jìn)細(xì)胞呼吸作用的增強(qiáng)，導(dǎo)致胞內(nèi)ATP水平的提高，ATP水平的提高，不僅為細(xì)胞生產(chǎn)提供了能量，而且有利于聚谷氨酸合成酶催化合成γ－PGA。

圖2 不同氧載體對γ－PGA發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of different oxygen vector on the fermentation ofγ－PGA注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)，圖3～圖4同。

由圖2B可知，添加正十六烷的實驗組顯示了最高的菌體生物量，OD600達(dá)到19.5，對照組為15.6，說明添加正十六烷有利于菌體的生長;而添加正己烷、正庚烷、正十二烷的實驗組，菌體生物量(OD600)與對照組相比沒有顯著性差別(p＞0.05)。

由圖2C可知，與對照組相比，添加正十六烷并未顯著增加發(fā)酵液的粘度(p＞0.05)，此外，添加正己烷、正十六烷、正庚烷的實驗組都顯示了較高的粘度，可見發(fā)酵液的粘度與γ－PGA產(chǎn)量并不完全正相關(guān)。綜上，選取正十六烷為最優(yōu)氧載體種類，進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 正十六烷添加量對γ－PGA發(fā)酵的影響

由圖3A和3B可知，當(dāng)正十六烷的添加量從0.1%增加到0.5%時，菌體生物量(OD600)逐漸上升，菌體生物量(OD600)從16.3增加到23.91;γ－PGA產(chǎn)量也從13.2 mg/mL增加到18.8 mg/mL。但當(dāng)正十六烷添加量超過0.5%時，反而不利于菌體的生長與γ－PGA的生成，添加量為1.0%和2.0%時，菌體生物量(OD600)分別為17.37和15.46;此時γ－PGA產(chǎn)量也有所降低，分別為15.22和13.21 mg/mL。正十六烷添加量為0.5%的實驗組的γ－PGA產(chǎn)量和菌體生物量(OD600)都顯著高于其他濃度的實驗組(p＜0.05)。

圖3 不同濃度正十六烷對γ－PGA發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different amount of n－h(huán)exadecane on the fermentation ofγ－PGA

有研究發(fā)現(xiàn)［21］，具有正鋪展系數(shù)的氧載體(如正十六烷)含量的增加會使氧傳遞系數(shù)的數(shù)值不斷增大，有利于氧的傳遞，但是，隨著正十六烷添加量過高，γ－PGA產(chǎn)量反而逐漸降低，可能是在低裝液量、高氧載體濃度時，培養(yǎng)基失水過多，從而影響了γ－PGA的產(chǎn)量。

發(fā)酵液粘度主要是由于高聚合度的γ－PGA引起，圖3C實驗結(jié)果表明，粘度的大小與γ－PGA產(chǎn)量并不完全正相關(guān)，與上文圖2C結(jié)論相同，猜測粘度的大小與γ－PGA產(chǎn)量、γ－PGA分子量大小等多重因素有關(guān)。粘度僅可以作為γ－PGA產(chǎn)量的一個輔助評價指標(biāo)。綜上，選擇0.5%濃度為正十六烷的最優(yōu)添加量。

2.4 正十六烷的添加時間對γ－PGA發(fā)酵的影響

氧載體的添加會增加培養(yǎng)基的溶氧水平，進(jìn)而影響菌體的生長及代謝水平。因此，氧載體的添加時間對發(fā)酵過程有重要影響，實驗通過改變正十六烷的添加時間考察其對γ－PGA發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4A可知，γ－PGA產(chǎn)量隨著氧載體添加時間的延遲而顯著降低(p＜0.05)，在0 h添加氧載體的實驗組γ－PGA產(chǎn)量最高，為18.48 mg/mL，而在36 h時添加正十六烷時，γ－PGA含量降到13.4 mg/mL。由圖4B可知，在0 h添加氧載體時，菌體生物量(OD600nm)顯著高于其他添加時間的實驗組(p＜0.05)，此時發(fā)酵液的菌體生物量(OD600nm)最高，達(dá)到了20.9。從圖4C可知，隨著氧載體添加時間的推遲，發(fā)酵液的粘度也均逐漸下降。

圖4 正十六烷添加時間對γ－PGA發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of n－h(huán)exadecane addition time on the fermentation ofγ－PGA

可能在發(fā)酵后期，菌體處于平臺期，外源有機(jī)溶劑的添加會對該階段的細(xì)胞生長有一定的抑制作用，進(jìn)而影響到γ－PGA的合成。小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε－聚賴氨酸過程中，發(fā)酵初始添加氧載體正十二烷可以顯著提高ε－聚賴氨酸的產(chǎn)量［22］;而在茯苓菌深層發(fā)酵過程中，48 h添加氧載體，可以最大程度上提高胞外多糖和茯苓酸產(chǎn)量［23］，這可能是由于發(fā)酵產(chǎn)物的代謝途徑不同所致。綜合菌體生物量(OD600)、γ－PGA產(chǎn)量和發(fā)酵液粘度的實驗結(jié)果，選取0 h加入正十六烷為本研究的最佳方案。

2.5 最優(yōu)氧載體添加方案下γ－PGA搖瓶發(fā)酵曲線

由于正十六烷的添加改善了發(fā)酵體系的傳氧，進(jìn)而改變整個發(fā)酵過程，因此我們考察了在氧載體添加后整個發(fā)酵過程中γ－PGA產(chǎn)量、菌體生長及殘?zhí)呛康膭討B(tài)變化，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，γ－PGA產(chǎn)量、菌體濃度和殘?zhí)呛慷荚趧討B(tài)變化。發(fā)酵18 h以前，γ－PGA產(chǎn)量和菌體生物量(OD600)隨著發(fā)酵的進(jìn)行都迅速增加，而殘?zhí)请S之迅速下降，此時微生物生長和發(fā)酵產(chǎn)γ－PGA的效率最高。發(fā)酵24～48 h期間，殘?zhí)呛恳恢本S持在較低水平，說明培養(yǎng)基營養(yǎng)成分基本耗盡，菌體濃度基本維持不變，γ－PGA產(chǎn)量緩慢上升，到發(fā)酵48 h時，γ－PGA產(chǎn)量達(dá)到最高值為18.62 mg/mL。48 h以后，菌體濃度有所降低，表明此時由于菌體衰老發(fā)生了部分自溶，此時的γ－PGA產(chǎn)量也有所下降。研究表明γ－PGA生產(chǎn)菌株在發(fā)酵48 h，72 h甚至更長時間 γ－PGA產(chǎn)量達(dá)到最高［24－26］。綜上，選擇 48 h 為最適的發(fā)酵周期，此時的γ－PGA產(chǎn)量達(dá)到18.62 mg/mL，相比不加氧載體的對照組(13.91 mg/mL)提高了30%以上。

圖5 搖瓶中添加氧載體的γ－PGA發(fā)酵過程曲線Fig.5 The curve ofγ－PGA fermentation with oxygen vector in shake flask

3 結(jié)論

本研究探討了不同氧載體(包括正己烷、正庚烷、正十二烷、正十六烷)對于枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ－PGA的發(fā)酵體系中 γ－PGA產(chǎn)量、菌體生物量(OD600)、發(fā)酵液粘度的影響，篩選出了最適氧載體(正十六烷)，并對其添加濃度、添加時間進(jìn)行了優(yōu)化。通過對氧載體種類、添加量、加入時間的單因素實驗，結(jié)果表明正十六烷為最適氧載體，其最佳加入條件是發(fā)酵0 h時添加0.5%正十六烷。此條件下的發(fā)酵曲線表明，48 h時γ－PGA產(chǎn)量達(dá)到最高值為18.62 mg/mL，相比對照提高了30%以上，此時發(fā)酵液具有較高的粘度。本研究建立了枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)γ－PGA中氧載體的添加策略，使得γ－PGA產(chǎn)量顯著提高(p＜0.05)。加入少量正十六烷在有效提高γ－PGA產(chǎn)量的同時保證了其品質(zhì)，對工業(yè)生產(chǎn)有一定應(yīng)用價值。