馬婷婷 黨嫣# 賈培麗 鮮建橋 劉雙月 許濤 王愛梅

鈣蛋白酶2(Calpain 2)是半胱氨酸蛋白酶家族成員之一，當(dāng)鈣離子(Ca2+)增多時可被激活，進而觸發(fā)其下游轉(zhuǎn)錄因子的促凋亡活動，導(dǎo)致細胞凋亡[1]。研究表明，Calpain 2可在小鼠耳蝸中表達，并且隨著順鉑給藥濃度的逐漸增大，小鼠耳蝸內(nèi)Calpain 2的表達亦逐漸增強，進而誘導(dǎo)耳蝸毛細胞凋亡，造成小鼠聽力損失[2～4]。葛根素是從野葛根中提取出的一種黃酮苷類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用[5]，臨床已用于治療冠心病、高血壓、突發(fā)性聾等多種疾病[6]。最新文獻報道，葛根素可有效抑制卡那霉素的耳毒性，改善小鼠的聽功能[7]。然而，葛根素是否也能有效防護順鉑的耳毒性及其防護作用是否與Calpain 2有關(guān)，目前尚不清楚。因此，本研究擬通過觀察葛根素對順鉑致毒小鼠耳蝸Calpain 2表達的影響，探討葛根素對順鉑耳毒性的防護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 健康雄性BALB/c小鼠60只，體重18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供；順鉑購自美國Sigma公司；葛根素購自成都天臺山制藥有限公司；兔抗Calpain 2多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自美國EarthOx公司；Smart EP&OAE 聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)由美國IHS公司生產(chǎn)。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物及分組 60只小鼠隨機分成4組，每組15只(30耳)，其中，順鉑組腹腔注射順鉑4.5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5天；葛根素組腹腔注射葛根素 200 mg·kg-1·d-1，連續(xù)14天；順鉑+葛根素組先提前腹腔注射葛根素 200 mg·kg-1·d-19天，在第10天同時腹腔注射順鉑 4.5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)5天；對照組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)14天。用藥期間每天監(jiān)測小鼠體重以調(diào)整藥量。

1.2.2聽性腦干反應(yīng)(ABR)測試 各組小鼠在給藥前后均進行ABR測試。用1%戊巴比妥鈉90 mg/kg對小鼠進行腹腔麻醉；給予小鼠短純音(tone burst)刺激，8、12和24 kHz 3個頻率，記錄ABR閾值。帶通濾波100～3 000 Hz，疊加1 024次，掃描時程16.0 ms。聲刺激強度從95 dB SPL開始，以5 dB逐次遞減，以剛引出ABR波Ⅰ并至少重復(fù)2次的最小刺激聲強度為反應(yīng)閾；同一刺激頻率下給藥前后的反應(yīng)閾差值記為ABR閾移[8]。

1.2.3耳蝸標(biāo)本處理 動物停藥并測試完ABR后立即斷頭，速取聽泡。體視顯微鏡下暴露耳蝸，并從蝸頂緩慢灌入含4%多聚甲醛的0.01 mol/L PBS(pH 7.4)，然后將標(biāo)本放入相同溶液中4 ℃下固定24 h。PBS清洗后放入10% EDTA中4℃下脫鈣3～5天備用。

1.2.4耳蝸基底膜毛細胞計數(shù) 取脫鈣后耳蝸，在體視顯微鏡下分離基底膜并平鋪于載玻片上，滴加羅丹明-鬼筆環(huán)肽(1∶200稀釋)溶液，室溫避光染色1 h，然后封片。熒光顯微鏡下選取0.17 mm標(biāo)尺為一個視野，從基底膜頂端向底端連續(xù)觀察毛細胞，并將毛細胞計數(shù)結(jié)果輸入計算機，應(yīng)用耳蝸毛細胞定量軟件(KHRI Cytocochleograms，Version 3.0)進行分析。

1.2.5Calpain 2免疫熒光染色 取脫鈣后耳蝸，經(jīng)PBS沖洗后進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋，然后沿蝸軸正中行5 μm連續(xù)切片。切片在60 ℃下烘烤1 h后脫蠟至水，PBS清洗后抗原修復(fù)10 min；封閉液室溫孵育1 h后，滴加抗Calpain 2抗體(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜；取出切片用PBS清洗后，滴加熒光二抗(1∶200稀釋)，37 ℃孵育1 h；PBS清洗后封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照，陰性染色切片用PBS代替一抗，其他過程不變。

每組隨機取10張免疫熒光圖片，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件在同等條件下測量各組耳蝸外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)和血管紋等部位Calpain 2陽性產(chǎn)物的光密度值，光密度值越大，表示陽性反應(yīng)越強烈[9]。

1.2.6Calpain 2蛋白質(zhì)印跡檢測 小鼠斷頭后速取耳蝸組織，4個耳蝸為一份樣本，加入RIPA 裂解液，于冰下超聲粉碎，然后4 ℃下離心25 min (12 000 rpm/min)，取上清測定蛋白含量。蛋白樣本SDS聚丙烯凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Calpain 2抗體(1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜。TBST清洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育1.5 h，TBST清洗后，ECL法發(fā)光顯影。全自動凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行半定量分析，以GAPDH作為內(nèi)參照物，Calpain 2/GAPDH比值代表Calpain 2的蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1ABR閾移 由表1可見，與對照組相比較，順鉑組小鼠各頻率ABR閾移均顯著增大(P<0.01)；順鉑+葛根素組各頻率ABR閾移雖較對照組增大(P<0.01)，但比順鉑組明顯減小(P<0.01)；葛根素組與對照組小鼠ABR閾移無明顯差異(P>0.05)(表1)。

表1 各組小鼠各頻率的ABR閾移(n=30耳)

注：▲與對照組比較，P<0.01；△與順鉑組比較，P<0.01

2.2耳蝸外毛細胞計數(shù)結(jié)果 由表2可見，與對照組相比較，順鉑組小鼠耳蝸基底膜各回外毛細胞缺失率均明顯增大(P<0.01)；與順鉑組相比，順鉑+葛根素組底回和中回外毛細胞缺失明顯減少 (P<0.01)；葛根素組與對照組相比較，各回外毛細胞缺失率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 各組小鼠耳蝸基底膜各回外毛細胞缺失率

注：▲與對照組比較，P<0.01；△與順鉑組比較，P<0.01

2.3Calpain 2 免疫熒光染色結(jié)果 Calpain 2在四組小鼠耳蝸的外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋三個部位均有表達(綠色熒光)(圖1)。顯微圖像分析結(jié)果顯示，順鉑組小鼠耳蝸上述部位Calpain 2 表達較對照組明顯增強(P<0.01)；順鉑+葛根素組小鼠耳蝸Calpain 2表達較順鉑組明顯減弱(P<0.01),葛根素組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖1 各組小鼠耳蝸Calpain 2的表達(免疫熒光染色,標(biāo)尺=20 μm)

表3 各組小鼠耳蝸Calpain 2表達的平均光密度值(n=4)及Calpain2/GAPDH比值

注：與對照組相比，▲P<0.01，*P<0.05；與順鉑組相比，△P<0.01；#P<0.05

2.4Calpain 2蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果 對照組和葛根素組小鼠耳蝸Calpain 2的電泳條帶較弱，而順鉑組小鼠耳蝸Calpain 2的電泳條帶明顯比對照組深；順鉑+葛根素組小鼠耳蝸Calpain 2的電泳條帶則較順鉑組明顯減弱(圖2)。半定量分析結(jié)果顯示，順鉑組Calpain 2/GAPDH比值明顯大于對照組(P<0.01)；順鉑+葛根素組Calpain 2/GAPDH比值明顯小于順鉑組(P<0.05)，葛根素組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

圖2 各組小鼠耳蝸Calpain 2電泳條帶

3 討論

Calpain是一類依賴Ca2+激活的中性半胱氨酸蛋白酶，主要包括兩種同分異構(gòu)體，即Calpain 1和Calpain 2。Calpain 1只需微摩爾濃度的Ca2+就可被激活，故又稱μ-Calpain；而Calpain 2則需毫摩爾濃度的Ca2+才能被激活，故又稱m-Calpain。目前大量研究表明，Calpain參與了物理或化學(xué)因素引起的聽力損傷，Yamaguchi等[10,11]證明Calpain介導(dǎo)的噪聲性聾機制與氧化應(yīng)激引起的細胞間通訊蛋白CX34表達下降有關(guān);另外，Calpain可激活下游凋亡通路相關(guān)因子，誘導(dǎo)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細胞凋亡，介導(dǎo)高糖所引起的大鼠聽覺損傷[12]；另有研究證明，在卡那霉素致聾小鼠耳蝸血管紋上Calpain高表達，與對照組相比差異顯著[13]；還有研究發(fā)現(xiàn)，Calpain在下丘神經(jīng)元的表達水平與水楊酸引起的SD大鼠聽力損傷程度成正比[14]；本實驗室前期研究結(jié)果表明，Calpain 2介導(dǎo)了順鉑的耳毒性[2～4]；張立偉等[2]觀察到不同濃度順鉑可誘導(dǎo)離體小鼠耳蝸Calpain 2的高表達，使毛細胞凋亡明顯增多；Chang等[3]給成年小鼠連續(xù)5天腹腔注射不同濃度順鉑后，小鼠ABR閾移明顯增大，同時耳蝸毛細胞內(nèi)Calpain 2的表達較對照組明顯增強，并且隨著順鉑給藥濃度的逐漸加大，Calpain 2的表達也逐漸增強。本研究發(fā)現(xiàn)順鉑組小鼠耳蝸外毛細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)及血管紋中Calpain 2的表達均較對照組明顯增強，同時ABR閾移和外毛細胞缺失率較對照組明顯增大，進一步證明Calpain 2介導(dǎo)了順鉑的耳毒性，與上述研究結(jié)果一致。

葛根素是中藥葛根的主要活性成分，具有抗氧化作用，可通過減少ROS的過量生成以減輕氧化應(yīng)激對神經(jīng)細胞和成骨細胞的損傷[15,16]。都君君等[17]研究表明，葛根素可顯著減少妊娠期糖尿病大鼠腦組織內(nèi)丙二醛含量，增強超氧化物歧化酶含量，減輕氧化應(yīng)激對腦組織的損傷；此外，葛根素還具有抗凋亡作用，可通過抑制Calpain蛋白的高表達，以減少高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞凋亡[18]。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，葛根素對突發(fā)性聾、老年性聾和藥物性聾均具有明顯療效。葛根素可明顯降低突發(fā)性聾患者體內(nèi)過氧化脂質(zhì)水平，同時增強超氧化物歧化酶的水平，減輕氧化應(yīng)激引起的聽功能損傷[19]。最近有臨床報道稱，利用葛根素與神經(jīng)節(jié)苷脂鈉聯(lián)合治療突發(fā)性聾后，患者聽功能明顯改善[20]；葛根素聯(lián)合聲頻共振對早期老年性聾具有良好的治療效果，并能延緩老年性聾的發(fā)生，減輕耳鳴的癥狀[21]；同時，葛根素還能有效抑制卡那霉素的耳毒性，改善小鼠的聽功能，這可能與葛根素抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p50和NF-κB p65的活化易位，減少毛細胞凋亡有關(guān)[7,8]。本研究結(jié)果顯示，順鉑+葛根素組小鼠耳蝸Calpain 2表達較順鉑組明顯減弱，同時ABR閾移和外毛細胞缺失率較順鉑組亦明顯減小，表明葛根素亦可有效防護順鉑對小鼠的耳毒性損傷，這可能與其下調(diào)順鉑誘導(dǎo)的Calpain 2高表達有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)葛根素本身對小鼠聽功能無損害效應(yīng)，提示葛根素具有廣闊的應(yīng)用前景；至于葛根素發(fā)揮防護作用的具體機制，尚有待今后進一步研究。