曹學(xué)全 章輝 盧洪勝 戴岳楚 魏科娜 楊朝暉 范廣民 顧華敏

甲狀腺癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在過(guò)去幾十年中其發(fā)病率已經(jīng)增加了3倍，超過(guò)四分之三是甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1-2]。PTC的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，研究與PTC發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的基因具有重要意義。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是惡性腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，在EMT過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為上皮標(biāo)志物如E-鈣粘素等表達(dá)下降，細(xì)胞黏附減弱，間質(zhì)標(biāo)志物如波形蛋白等表達(dá)增加[3]。同源形成素樣蛋白2（forminlike protein 2，F(xiàn)MNL2）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的一種新基因，屬于形成素同源蛋白家族成員之一。FMNL2可作為Rho家族鳥(niǎo)苷三磷酸酶的效應(yīng)分子，并在致癌中發(fā)揮重要作用。FMNL2在肺癌、惡性黑色素瘤等多種惡性腫瘤中表達(dá)增加，并且與侵襲、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[4-6]。關(guān)于PTC組織中FMNL2表達(dá)的臨床意義及與EMT相關(guān)蛋白關(guān)系的研究鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究采用免疫組化En Vision法檢測(cè)FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白在PTC和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異，分析FMNL2和EMT相關(guān)蛋白的關(guān)系及對(duì)PTC發(fā)生、發(fā)展的可能作用機(jī)制，為PTC的分子靶向治療提供新思路。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年1月至2018年1月我院住院行手術(shù)切除PTC標(biāo)本80例，術(shù)后均經(jīng)病理檢查證實(shí)為PTC。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療及生物學(xué)治療。80例PTC患者中，男26例，女54例；年齡21～77（45.37±12.04）歲，其中＜45歲42例，≥45歲38例。腫瘤直徑≤2cm 56例，＞2cm 24例；伴有包膜侵犯28例，無(wú)包膜侵犯52例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例；參照2010年第7版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）/國(guó)際抗癌聯(lián)合會(huì)（UICC）制定的甲狀腺癌分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期27例。同時(shí)選取其中30例患者距離腫瘤2cm的相應(yīng)癌旁組織（經(jīng)病理檢查為正常甲狀腺組織）作為對(duì)照組。

1.2 主要試劑 FMNL2兔抗人多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，E-鈣粘素和波形蛋白鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司，EnVision通用試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）均購(gòu)自廣州基因公司。

1.3 免疫組化方法 應(yīng)用免疫組化En Vision法檢測(cè)FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達(dá)。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫孵育10min，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)，3%BSA封閉30min，分別滴加一抗（FMNL2抗體濃度為1∶200，E-鈣粘素和波形蛋白均為1∶100）4℃過(guò)夜，滴加二抗（En Vision免疫組化檢測(cè)試劑），DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸分化、乙醇及二甲苯脫水和樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性組織作陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定 以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)淡黃色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性，F(xiàn)MNL2和波形蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)，E-鈣粘素定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜。在光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取至少5個(gè)高倍視野（×400），觀察并記錄每張切片的染色強(qiáng)度和面積，通過(guò)半定量積分法進(jìn)行判定。染色強(qiáng)度：無(wú)顯色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比≤5%為 0分；6%～10%為1分；11%～20%為 2分；21%～50%為 3分；＞50%為4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比計(jì)分的乘積為每例的最終積分。＜3分為陰性，≥3分為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，PTC中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白之間表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTC和癌旁組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達(dá) FMNL2、波形蛋白在PTC組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為 61.25%（49/80）和 76.25%（61/80），癌旁組織分別為 13.33%（4/30）和 20.00%（6/30），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=20.064、28.994，均P＜0.05）；而 E-鈣粘素在PTC組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為32.50%（26/80），顯著低于癌旁組織的80.00%（24/30），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.855，P＜0.05）。見(jiàn)圖 1（見(jiàn)插頁(yè)）。

2.2 PTC組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 FMNL2、波形蛋白表達(dá)在包膜有無(wú)侵犯、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及不同臨床分期者間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而在不同年齡、性別和腫瘤直徑者中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；E-鈣粘素在包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅲ～Ⅳ期PTC者中陽(yáng)性表達(dá)率低，在無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Ⅰ～Ⅱ期PTC者中陽(yáng)性表達(dá)率高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而在不同年齡、性別和腫瘤直徑者中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 PTC組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PTC原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白的表達(dá)情況 47例原發(fā)灶組織中FMNL2陽(yáng)性表達(dá)率為76.60%（36/47），對(duì)應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為100.00%（47/47），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中FMNL2 表達(dá)明顯高于原發(fā)灶（χ2=9.553，P＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為100.00%（47/47），高于原發(fā)灶的91.49%（43/47），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.178，P＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中E-鈣粘素陽(yáng)性表達(dá)率為4.25%（2/47），低于原發(fā)灶的17.02%（8/47），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.028，P＜0.05）。

2.4 PTC組織中FMNL2、E-鈣粘素和波形蛋白表達(dá)的相關(guān)性 PTC組織中FMNL2、波形蛋白表達(dá)與E-鈣粘素表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.325、-0.554，均P＜0.05），F(xiàn)MNL2表達(dá)與波形蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.340，P＜0.05）。見(jiàn)表 2、3。

3 討論

據(jù)報(bào)道，EMT和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是造成腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的原因[7]。EMT在胚胎發(fā)育過(guò)程中是一種從上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的重要表型，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。EMT的特征是上調(diào)間充質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白，包括N-鈣黏著蛋白和波形蛋白，以及下調(diào)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記蛋白，如E-鈣粘素，MMPs和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌增多，基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)被破壞，從而細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)遷移能力[9]。本研究結(jié)果顯示，PTC組織中波形蛋白陽(yáng)性表達(dá)顯著高于癌旁正常組織（P＜0.05），而E-鈣粘素在PTC組織中表達(dá)下調(diào)，明顯低于癌旁正常組織（P＜0.05），提示EMT相關(guān)蛋白（波形蛋白和E-鈣粘素）異常表達(dá)可能在PTC發(fā)生過(guò)程中起作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，波形蛋白在PTC包膜侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅲ～Ⅳ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中陽(yáng)性表達(dá)率高，而在PTC無(wú)包膜侵犯、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Ⅰ～Ⅱ期及原發(fā)灶組織中陽(yáng)性表達(dá)率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而E-鈣粘素表達(dá)情況則相反，表明EMT相關(guān)蛋白表達(dá)狀態(tài)改變可能參與PTC的局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床進(jìn)展的過(guò)程。

表2 PTC組織中FMNL2、波形蛋白表達(dá)與E-鈣粘素表達(dá)的相關(guān)性

表3 PTC組織中FMNL2、波形蛋白表達(dá)的相關(guān)性

FMNL2編碼蛋白質(zhì)是進(jìn)化上保守formin家族的蛋白質(zhì)成員，這些蛋白質(zhì)是細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)劑。FMNL2具有影響肌動(dòng)蛋白聚合和肌動(dòng)蛋白絲形成的結(jié)構(gòu)域，是建立在遷移和侵襲過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞邊緣突起的肌動(dòng)蛋白聚集因子[10-11]。在生理和病理情況下，F(xiàn)MNL2在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如絲狀體形成、細(xì)胞遷移、胞質(zhì)分裂、細(xì)胞黏附、細(xì)胞極性和腫瘤進(jìn)展等[12]。有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)MNL2具有Rho家族鳥(niǎo)苷三磷酸酶結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)時(shí)可形成偽足，在結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用[13]。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)MNL2 mRNA水平在舌鱗狀細(xì)胞癌中顯著升高，且其高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤密切相關(guān)，表明FMNL2作為轉(zhuǎn)移的正調(diào)控因子。多因素分析顯示FMNL2表達(dá)具有獨(dú)立的預(yù)后意義[14]。本研究采用免疫組化En Vision法檢測(cè)PTC和相應(yīng)癌旁正常組織中FMNL2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，PTC組織中FMNL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05），并且PTC隨著包膜侵犯、淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移及臨床分期增加，F(xiàn)MNL2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)一步升高（P＜0.05），表明FMNL2表達(dá)升高可能與PTC的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。為了進(jìn)一步顯示FMNL2在PTC轉(zhuǎn)移中的作用，本研究檢測(cè)了原發(fā)灶和對(duì)應(yīng)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中FMNL2的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶組織中FMNL2表達(dá)明顯高于原發(fā)灶（P＜0.05），提示FMNL2表達(dá)升高可能會(huì)導(dǎo)致原發(fā)灶的一些癌細(xì)胞容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。

Li等[15]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MNL2通過(guò)Smad3效應(yīng)分子或者M(jìn)APK/MEK信號(hào)通路參與TGF-β誘導(dǎo)的EMT，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究還分析FMNL2與EMT相關(guān)蛋白的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FMNL2、波形蛋白表達(dá)與E-鈣粘素表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)MNL2表達(dá)與波形蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示在PTC組織中，F(xiàn)MNL2表達(dá)與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)密切相關(guān)，F(xiàn)MNL2過(guò)表達(dá)可能與EMT的發(fā)生有關(guān)。綜合上述研究結(jié)果，F(xiàn)MNL2和EMT相關(guān)蛋白異常表達(dá)可能聯(lián)合參與PTC的發(fā)生、惡性進(jìn)展過(guò)程，為PTC的靶向治療和預(yù)后判斷提供新思路。