張晉 袁哲

與骨髓來源干細胞相比，臍帶血造血干細胞具有獲取快速、來源廣泛、供者風(fēng)險低、移植物抗宿主病發(fā)生率低等優(yōu)點，臍帶血移植已被廣泛用于治療多種血液系統(tǒng)疾病[1]。然而，由于細胞總數(shù)有限，臍帶血造血干細胞移植并不適合用于年齡較大的患者。在臨床應(yīng)用中，有核細胞總數(shù)（total nucleated cells，TNC）是臍帶血供體選擇的主要依據(jù)，而臍帶血采集量和每單位體積的白細胞計數(shù)是決定TNC大小的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究回顧分析了389例臍帶血樣本的TNC和采集量以及影響二者的母嬰因素和采集處理因素，旨在優(yōu)化臍帶血的采集和實驗室處理流程，從而提高臍帶血的保存質(zhì)量。

材料與方法

一、材料

1.臍帶血采血袋：一次性使用塑料血袋（規(guī)格型號為200 ml，山東威高公司），血液保存液（含量為28 ml，成份為枸櫞酸、枸櫞酸鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖及腺嘌呤，批號為14101821，生產(chǎn)日期為20141018，有效期為201609，經(jīng)高壓蒸汽滅菌、無菌、無熱源、一次性使用）。本研究為回顧性分析，所有數(shù)據(jù)均來自計算機系統(tǒng)。不論是自體保存還是公共捐獻， 389 份臍帶血在采集之前均獲得產(chǎn)婦/家屬的知情同意并簽訂了保存/捐獻協(xié)議。

2.臍帶血采集對象：采集之前必須獲得產(chǎn)婦/ 家屬的知情同意，詳細詢問產(chǎn)婦的病史、妊娠史、傳染病史和遺傳病史并檢查各項檢驗結(jié)果；產(chǎn)婦年齡不小于18歲，孕齡不少于36周，無傳染性疾病，無惡性腫瘤及遺傳性疾病，無血液系統(tǒng)疾病及免疫系統(tǒng)疾病，妊娠期間無嚴(yán)重合并癥等；胎兒體重大于2 500 g，無畸形，無窒息、水腫、黃疸、感染；凡不符合以上要求者均應(yīng)排除在采集對象之外[2]。

3. 389份臍帶血的平均采集量為75 ml（30 ～170 ml）；TNC 數(shù)平均為 6.6，TNC 最小者為 2.1，最大者達28.3。母嬰因素中，母親平均年齡32歲；平均孕齡39周；新生兒平均體重3 399 g，最大為4 700 g，最小為2 500g；剖宮產(chǎn)為主要分娩方式，占69.9%；新生兒中男性偏多，占52.4%；產(chǎn)婦中多數(shù)為第1胎，占50.4%，少數(shù)為第2胎和第3胎。采集處理因素中，采集至計數(shù)間隔最短為1 h，最長為45 h；采集方式有第三產(chǎn)程采集、體外采集以及兩種方式混合采集，但以第三產(chǎn)程采集為主，占76.1%。

二、實驗方法

1.臍帶血采集：參照《臍帶血造血干細胞庫技術(shù)規(guī)范》和紐約臍帶血庫Rubinstein等[3]的分離方法，胎兒娩出后，在近胎盤端對臍帶穿刺部位進行嚴(yán)格消毒，將采血針于止血鉗固定部位上端5 cm處快速刺入臍靜脈，使臍帶血通過重力作用流入一次性采血袋內(nèi)，同時輕輕搖晃采血袋，使臍帶血和保存液充分混勻，直至采集結(jié)束。采集后放于4 ℃冰箱保存并在48 h內(nèi)完成細胞計數(shù)和分離冷凍。

2.臍帶血處理及冷凍：參照紐約臍帶血庫Rubinstein等[3]的分離方法并結(jié)合實際經(jīng)驗，根據(jù)白細胞、紅細胞和血漿密度不同的特性，將6%羥乙基淀粉生理鹽水溶液與臍血以1 : 5比例加入臍帶血血袋中，通過四步離心將富含有核細胞的白膜層分離提取，并于15 min內(nèi)將冷凍保護劑[細胞內(nèi)保護劑采用二甲基亞砜（DMSO），細胞外保護劑采用低分子右旋糖酐，二者等體積混合，使DMSO終濃度為10%]加入裝有白膜層的冷凍袋中，程序降溫后置于-196 ℃液氮中保存。

3. TNC檢測：輕輕搖晃使臍帶血充分混勻，無菌技術(shù)抽取0.5 ml，使用KX-21型全自動血液分析儀（日本SYSMEX）進行細胞計數(shù)。檢測用稀釋液、溶血劑和清潔液均為SYSMEX配套試劑；各項操作均遵守實驗室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程；每次開機后測定配套質(zhì)控品，結(jié)果合格后方可進行常規(guī)檢測；定期參加衛(wèi)生部臨床檢驗中心組織的室間質(zhì)量評價并全部通過。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。臍帶血采集量與新生兒體重的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，而與母親年齡、孕齡、采集至計數(shù)間隔、TNC的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)；TNC與母親年齡、孕齡、新生兒體重、采集至計數(shù)間隔和TNC的相關(guān)性分析均采用Spearman秩相關(guān)。孕齡、分娩方式兩組間采集量比較采用兩樣本t檢驗，新生兒性別兩組間采集量比較采用Mann-WhitneyU檢驗，新生兒體重、胎次、采集方式多組間采集量比較采用Kruskal-WallisH檢驗；臍帶血采集量、孕齡、分娩方式、新生兒性別兩組間TNC比較采用Mann-WhitneyU檢驗，新生兒體重、胎次、采集方式多組間TNC比較采用Kruskal-WallisH檢驗。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、相關(guān)性分析

臍帶血采集量與TNC顯著相關(guān)（r= 0.723，P＜ 0.001）；母親年齡與采集量及TNC均無顯著相關(guān)；孕齡與采集量負(fù)相關(guān)（r= -0.119，P= 0.019），而與TNC正相關(guān)（r= 0.138，P= 0.007）；嬰兒出生體重與采集量及TNC均顯著正相關(guān)（r= 0.236,P＜0.001；r= 0.275，P＜ 0.001）；臍帶血采集至計數(shù)的時間間隔與采集量及TNC均無顯著相關(guān)（表1）。

表1 臍帶血采集量及TNC與母嬰及采集處理因素相關(guān)性分析

二、分組比較

TNC隨著臍帶血采集量的增加而增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001）；按是否足月，將孕齡分為＜ 37周和≥37周，隨著孕齡的延長，TNC增加（P= 0.038）而臍帶血采集量并無變化；在嬰兒出生體重方面，臍帶血的采集量和TNC均隨出生體重的增加而增加（P＜ 0.001）；剖宮產(chǎn)的臍帶血采集量雖高于陰道分娩（P＜ 0.001），但其 TNC 不及陰道分娩；在嬰兒性別方面，男嬰與女嬰在臍帶血采集量和TNC之間無差異；產(chǎn)婦胎次數(shù)與臍帶血采集量和TNC之間無相關(guān)性；采用單一方式采集的臍帶血，在采集量和TNC之間無差異，但均高于采用混合方式采集的臍帶血（表2）。

表2 母嬰及采集處理因素對臍帶血采集量及TNC的影響

討 論

臍帶血造血干細胞移植有著廣闊的臨床應(yīng)用前景，臨床中評價移植用臍帶血質(zhì)量的常用指標(biāo)為TNC以及由此計算的CD34+細胞總數(shù)和集落總數(shù)，而TNC的大小主要取決于臍帶血采集量和每單位體積白細胞計數(shù)值。本研究對評價臍帶血保存質(zhì)量的采集量和TNC進行了影響因素的相關(guān)性分析和分組探討，其中母嬰因素包括母親年齡、孕齡、新生兒出生體重、分娩方式、新生兒性別以及懷孕胎次，采集處理因素包括臍帶血采集至計數(shù)的時間間隔以及臍帶血的采集方式。

臍帶血采集量通常被作為臍帶血處理前是否廢棄的直接標(biāo)準(zhǔn)，2011年對5910份臍帶血廢棄原因的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高達30%的臍帶血因采集量不足被廢棄[4]。有研究顯示，臍帶血采集量與反映臍帶血重建造血潛能的TNC、CD34+細胞總數(shù)和集落總數(shù)均具有明顯相關(guān)性，采血量越多，TNC值越高，能夠滿足的高體重患者數(shù)越多，庫存臍帶血的利用率就越高[5]。本研究中臍帶血采集量與TNC呈顯著正相關(guān)，隨著采集量的增加，TNC數(shù)呈穩(wěn)定上升，說明采集技術(shù)是影響臍帶血質(zhì)量的關(guān)鍵因素。為提高庫存臍帶血的TNC，以適合更多更大體重的患者使用，實際工作中應(yīng)優(yōu)化臍帶血的采集方法（第三產(chǎn)程或體外采集）或通過設(shè)定更加合理的采集對象標(biāo)準(zhǔn)（出生體重較大嬰兒），從而提高臍帶血的采集量，這與羅曉菊等[6]研究結(jié)果相同。

在母嬰因素中，孕齡與TNC呈正相關(guān)，TNC隨孕齡的延長而增加，這可能與胎兒體重隨孕齡增加有關(guān)，這一結(jié)果與Robert等[7]結(jié)果基本一致。嬰兒出生體重與臍帶血采集量和TNC均呈明顯正相關(guān)，將體重按照每增加500 g分為4組，隨著體重的增加，臍帶血采集量和TNC均呈穩(wěn)定上升趨勢，說明嬰兒出生體重是影響臍帶血質(zhì)量的關(guān)鍵因素，這與吳潔瑩等[8]報道的嬰兒體重是預(yù)測臍帶血造血潛能重要指標(biāo)的結(jié)果一致。以往研究認(rèn)為，陰道分娩可能通過應(yīng)激反應(yīng)、壓力作用等刺激細胞因子分泌增加從而導(dǎo)致臍帶血中含有較高數(shù)量的原始細胞[9]，本研究中經(jīng)陰道分娩的臍帶血TNC雖高于剖宮產(chǎn)，但無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與分娩方式的構(gòu)成比例不同有關(guān)。近年來我國的剖宮產(chǎn)數(shù)量逐年增加（本研究中高達70%），其中相當(dāng)一部分產(chǎn)婦未達到自然孕齡或缺乏醫(yī)學(xué)指征，這些因素都可能導(dǎo)致有核細胞計數(shù)低于正常狀態(tài)的陰道分娩。今后研究若擴大標(biāo)本數(shù)量，其結(jié)果對評價分娩方式尤其是陰道分娩對臍帶血TNC含量影響的意義會更大。與男嬰相比，女嬰的臍帶血TNC數(shù)量略有增加，這與吳潔瑩等[8]報道一致，但二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與本研究標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)。

在采集處理因素中，第三產(chǎn)程采集法即體內(nèi)采集法，即待胎兒娩出后，立即用止血鉗夾住臍帶，使用碘酒消毒后進行臍靜脈穿刺，一般可在胎兒娩出10 s內(nèi)獲得臍帶血，而體外采集法為待胎盤剝離后再進行臍帶消毒和臍帶血采集[10]。與體外采集法相比，第三產(chǎn)程采集因采集及時可獲得較多血量，但本研究并未發(fā)現(xiàn)兩者在采集量上存在統(tǒng)計學(xué)差異，可能和本研究納入的標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)，但采用單一方式獲得的臍帶血量和TNC均高于采用混合方式采集的臍帶血。

綜上所述，該研究通過分析母嬰因素及采集處理因素對臍帶血采集量和TNC的影響，為臨床合理選擇采集對象以及實驗室有效改進操作方法提供了重要的參考依據(jù)。研究結(jié)果提示為了提高臍帶血產(chǎn)品的保存質(zhì)量，減少不必要的資源浪費，應(yīng)側(cè)重選擇孕齡較長、胎兒體重較大、經(jīng)陰道分娩的產(chǎn)婦作為臍帶血的提供者，同時實驗室應(yīng)首先處理采集量較大的臍帶血。