哈斯高娃 曹中朝 劉東華

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種高效的化療藥物，廣泛應(yīng)用于臨床癌癥的治療[1-2]。但是，這種藥物可以引起急性和慢性心臟毒性，包括心動(dòng)過速、心律失常、低血壓、短暫性左心室功能抑制，甚至難治性遲發(fā)性心肌病[3-4]。此外，隨著DOX劑量的增加，DOX引起的心臟毒性會(huì)加重。當(dāng)DOX積累劑量達(dá)到700 mg/m2時(shí)，心衰發(fā)生率將增加到48%[5]。盡管DOX有強(qiáng)大和有效的功能，但因具明顯的副作用，使其應(yīng)用十分有限。

硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）過去被認(rèn)為是一種有毒氣體，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其是除一氧化氮和一氧化碳外的第三種氣體信號(hào)分子，對(duì)心血管系統(tǒng)有多種功能[6]。Huang等[7]報(bào)道外源性H2S對(duì)高糖誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞炎癥和毒性具有保護(hù)作用。值得注意的是，近年來許多研究發(fā)現(xiàn)H2S能夠拮抗DOX導(dǎo)致的心肌細(xì)胞毒性[8-9]。然而，H2S對(duì)抗DOX發(fā)揮心肌保護(hù)作用的分子機(jī)制尚未完全闡明。

本研究首先通過探討H2S供體NaHS對(duì)DOX處理的H9c2細(xì)胞活力和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)ROS、MDA和SOD水平的影響，明確H2S對(duì)DOX心肌毒性的保護(hù)作用。文獻(xiàn)報(bào)道，SIRT1具有抗氧化作用[10]。那么，SIRT1是否參與H2S抗DOX心肌毒性作用機(jī)制。本研究通過探討H2S對(duì)DOX作用下的H9c2細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的影響以及加入SIRT1抑制劑能否阻斷H2S對(duì)DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞毒性的抑制作用，以明確SIRT1對(duì)H2S抗DOX心肌毒性的介導(dǎo)作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

（一）實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM培養(yǎng)基購買于美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國GIBCO公司。MTT試劑購買于美國Sigma公司。MDA、SOD檢測試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所。ROS檢測試劑盒來源于上海碧云天生物公司。SIRT1和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2細(xì)胞來源于上海中科院細(xì)胞庫。使用含10%胎牛血清和1%青霉素- 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞。每隔1 ～ 2 d進(jìn)行細(xì)胞傳代處理。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時(shí)給予藥物處理。探討H2S對(duì)DOX心肌毒性的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組（Control組），5 μmol/L DOX 處理組（A 組），5 μmol/L DOX 和 400 μmol/L NaHS 共同處理組（B 組），400 μmol/L NaHS 單獨(dú)處理組（C組），5 μmol/L DOX、400 μmol/L NaHS 和 15 μmol/L Sirtinol共同處理組（D 組），15 μmol/L Sirtinol 單獨(dú)處理組（E組）。探討SIRT1是否參與H2S抗DOX心肌毒性作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組（Control組），5 μmol/L DOX 處 理 組（F 組），5 μmol/L DOX和 400 μmol/L NaHS 共同處理組（G 組），5 μmol/ L DOX、400 μmol/L NaHS 和 15 μmol/L Sirtinol共 同處理組（H 組），15 μmol/L Sirtinol 單獨(dú)處理組（I組）。

（二）MTT法檢測細(xì)胞活力

將H9c2細(xì)胞以1×104個(gè)/孔的種板密度均勻接種到96孔板中。先后加入Sirtinol、H2S和DOX處理細(xì)胞。藥物處理結(jié)束后，加入終濃度為0.5 mg/ ml的MTT溶液。于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h后，向每孔加入150 μl的DMSO溶解結(jié)晶紫。最后，于570 nm波長下，使用酶標(biāo)儀檢測樣品吸光值。

（三）MDA、SOD水平測定

將H9c2細(xì)胞以4×105個(gè)/孔的種板密度均勻接種到6孔板中。藥物處理結(jié)束后，使用胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)左右。然后，用PBS洗滌2次，1 000×g離心10 min，去掉上清液。將離心后的細(xì)胞沉淀進(jìn)行超聲破碎處理，隨后重懸細(xì)胞裂解液。根據(jù)廠家說明書，分別測定MDA和SOD的水平。

（四） DCFH-DA熒光探針法檢測ROS水平

收集 1×106～ 2×107個(gè) /ml的細(xì)胞，加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA。然后，于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3 ～ 5 min顛倒混勻一下細(xì)胞，使其與探針充分接觸。再用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，充分去除未結(jié)合的DCFH-DA。最后，使用流式細(xì)胞儀檢測ROS水平。

（五） Western blot法檢測蛋白表達(dá)水平

藥物處理結(jié)束后，使用蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白。運(yùn)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測定。然后，配置10%的分離膠，經(jīng)SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，進(jìn)行恒流轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)法）。用含5%脫脂牛奶的TBST溶液于常溫?fù)u床上封閉PVDF膜。封閉2 h后，使用一抗稀釋液于4℃搖床上孵育PVDF膜并過夜。TBST洗膜5次，每次5 min。加入二抗稀釋液于常溫?fù)u床上孵育PVDF膜2 h。向PVDF膜上加入顯影液，使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。最后，使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，細(xì)胞活力、ROS、MDA以及SOD水平和蛋白條帶灰度值均用表示，多組之間的細(xì)胞活力、ROS、MDA以及SOD水平和蛋白條帶灰度值的比較采用單因素方差分析法。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、H2S可抑制DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力降低和氧化應(yīng)激

結(jié)果如表 1 所示，NaHS（400 μmol/L，30 min）預(yù)處理可減輕DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞活力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 134.9，P＜ 0.001）。此外，NaHS預(yù)處理可抑制DOX引起的H9c2細(xì)胞ROS、MDA水平的增加以及SOD含量的降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 83.26，P＜ 0.001；F=271.4,P＜0.001；F=127.0,P＜ 0.001）。

二、H2S可抑制DOX對(duì)H9c2細(xì)胞SIRT1蛋白的下調(diào)作用

結(jié)果如圖1a所示，F(xiàn)組處理 6、12、24 h后的H9c2細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)水平分別是（0.45±0.03）、（0.27±0.02）、（0.25±0.03）， 較Control組（1.00±0.00）降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 611.1，P＜ 0.001）。結(jié)果如圖 1b所示，NaHS（400 μmol/L，30 min）預(yù)處理 H9c2細(xì)胞能抑制DOX引起的SIRT1蛋白表達(dá)的下調(diào)：Control組、F組、G組、H組的SIRT1蛋白表達(dá)水平分別1.00±0.00、0.31±0.03、0.60±0.04、1.09±0.09，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 123.4，P＜ 0.001）。

三、SIRT1抑制劑可阻斷H2S對(duì)DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞活力降低和氧化應(yīng)激的拮抗作用

結(jié)果如表 2所示，15 μmol/L Sirtinol組（SIRT1抑制劑）預(yù)處理30 min能減弱H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力降低的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 238.2，P＜ 0.001）。Sirtinol（15 μmol/ L，30 min）組預(yù)處理H9c2細(xì)胞后，可拮抗H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞ROS和MDA含量增加及SOD和GSH水平降低的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 112.0，P＜ 0.001；F= 93.73，P＜ 0.001；F= 84.92，P＜ 0.001）。

圖1 H2S和DOX對(duì)H9c2細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的影響

表1 H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力和氧化應(yīng)激的影響（± s）

表1 H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力和氧化應(yīng)激的影響（± s）

注：與Control組比較aP ＜ 0.001；與A組比較bP ＜ 0.001

分組 樣本量 細(xì)胞相對(duì)活力OD值（%） ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度（%） MDA（μmol/g） SOD（U/mg）Control組 3 100.00±0.00 100.00±0.00 34.18±1.56 53.69±1.44 A 組 3 54.58±1.58a 174.90±12.65a 72.65±2.66a 31.80±2.05a B 組 3 85.05±4.31b 126.08±6.25b 44.59±1.92b 48.06±1.56b C 組 3 100.22±4.46 91.86±1.66 32.93±1.56 55.93±1.58 F值 134.9 83.26 271.4 127.0 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 Sirtinol減弱H2S抑制DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞活力降低和氧化應(yīng)激（± s）

表2 Sirtinol減弱H2S抑制DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞活力降低和氧化應(yīng)激（± s）

注：與 Control組比較 aP ＜ 0.001，與 F 組比較，bP ＜ 0.001，與 G 組比較，cP ＜ 0.001

分組 樣本量 細(xì)胞相對(duì)活力OD值（%） ROS相對(duì)熒光強(qiáng)度（%） MDA（μmol/g） SOD（U/mg）Control組 3 100±0.00 100.00±0.00 35.84±2.22 53.03±3.16 F組 3 54.41±1.87a 184.60±11.33a 74.78±5.30a 29.26±0.85a G 組 3 85.37±3.62b 126.50± 7.57b 41.95±3.43b 52.61±2.26b H 組 3 71.11±2.11c 174.70± 5.50c 67.69±1.52c 35.33±1.95c I 組 3 97.53±1.45 98.03± 2.86 37.66±2.49 51.14±1.55 F值 238.20 112.00 93.73 84.92 P值 0.00 0.00 0.00 0.00

討 論

DOX是應(yīng)用最廣泛和最成功的抗腫瘤藥物之一，盡管DOX的臨床應(yīng)用受到累積和劑量依賴性心毒性效應(yīng)的限制。隨著癌癥幸存者人數(shù)的不斷增加，越來越需要制定預(yù)防策略和有效的治療方案，以對(duì)抗DOX誘導(dǎo)的心臟毒性，特別是遲發(fā)性心肌病。雖然DOX的心臟毒性作用以前已經(jīng)被研究過，但是這些作用的潛在機(jī)制仍有待闡明。越來越多的證據(jù)支持這一假設(shè)即自由基誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和壞死，是DOX誘導(dǎo)心臟毒性的關(guān)鍵因素[11-12]。

先前的研究結(jié)果表明，外源性H2S通過抗氧化效應(yīng)和抑制炎癥反應(yīng)，對(duì)DOX誘導(dǎo)的心臟毒性產(chǎn)生保護(hù)作用[13-15]。Guo等[15]人已經(jīng)證明外源H2S通過抑制H9c2細(xì)胞p38 MAPK/NF-κB通路拮抗DOX誘導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞毒性。H2S還通過抑制H9c2細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或抑制H9c2細(xì)胞過氧化物酶Ⅲ[9]的表達(dá)來降低DOX誘導(dǎo)的心臟毒性。此外，H2S可通過PI3K/Akt/FoxO3a通路保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞免受DOX誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用[8]。Su等[16]人已經(jīng)證明內(nèi)源性H2S的降低可能參與了DOX誘導(dǎo)心肌病的發(fā)病機(jī)制，因?yàn)镠2S能夠降低脂質(zhì)過氧化，增加抗氧化酶系統(tǒng)的活性，從而抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷。首先，為了探討H2S對(duì)DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞毒性的影響，使用MTT法檢測NaHS（H2S供體）對(duì)DOX作用下的H9c2細(xì)胞活力，本研究發(fā)現(xiàn)H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力降低具有保護(hù)作用。基于氧化應(yīng)激是DOX誘導(dǎo)心肌細(xì)胞毒性的一個(gè)重要機(jī)制。于是，本研究進(jìn)一步探討了H2S對(duì)DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。研究結(jié)果顯示H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激具有抑制作用。以上發(fā)現(xiàn)表明H2S可抑制DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞毒性以及氧化應(yīng)激，這與以往發(fā)現(xiàn)H2S具有對(duì)抗DOX引起的心肌細(xì)胞毒性相一致[13-15]。

Sirtuin-1（SIRT1）是一種高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴性組蛋白脫乙酰酶，在氧化應(yīng)激、炎癥和衰老中起著關(guān)鍵作用[17]。SIRT1對(duì)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)高度敏感，通過多個(gè)細(xì)胞靶點(diǎn)的去乙酰化作用來抵消活性氧的影響，從而發(fā)揮心臟保護(hù)和維持血管功能[18]。Wu等[19]人報(bào)道，H2S可通過SIRT1通路保護(hù)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡。最近的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1介導(dǎo)了H2S對(duì)H2O2作用下的新生小鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用[20]。以上資料提示SIRT1在H2S的心肌保護(hù)作用中發(fā)揮重要作用。那么，SIRT1是否在H2S抗DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性中同樣扮演重要作用，需要進(jìn)一步探討。于是，采用Western Blot法檢測了H9c2細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)水平，探討DOX對(duì)H9c2細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)DOX可濃度依賴性降低H9c2心肌細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)水平。這提示H2S抗DOX心肌毒性作用可能與其調(diào)控SIRT1蛋白表達(dá)有關(guān)。接著，本研究發(fā)現(xiàn)NaHS預(yù)處理可明顯抑制DOX對(duì)H9c2細(xì)胞SIRT1蛋白的下調(diào)作用。以上結(jié)果提示SIRT1蛋白可能介導(dǎo)了H2S的抗DOX心肌細(xì)胞毒性作用。于是，本研究大膽猜想使用SIRT1抑制劑Sirtinol后，H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞活力降低和氧化應(yīng)激的拮抗作用是否會(huì)被逆轉(zhuǎn)。本研究結(jié)果顯示，Sirtinol預(yù)處理能明顯取消H2S對(duì)DOX導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞活力降低的拮抗作用。此外，還發(fā)現(xiàn)使用Sirtinol抑制SIRT1可逆轉(zhuǎn)H2S對(duì)DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激即ROS和MDA水平的升高和SOD含量的降低的抑制作用。以上研究發(fā)現(xiàn)表明SIRT1對(duì)H2S抗DOX的心肌保護(hù)作用具有介導(dǎo)效應(yīng)，這與先前的研究報(bào)道相一致[19-20]。

綜上所述，本文率先證明H2S可以通過SIRT1抑制DOX誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞毒性。這些新發(fā)現(xiàn)不僅有助于理解H2S的重要生理作用，也為DOX引起的心肌毒性相關(guān)疾病的治療提供了新的思路。