黃三萍，權(quán) 婷，肖新生，唐滿生，歐光川

(湖南科技學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，湘南優(yōu)勢(shì)植物資源綜合利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 永州 425199)

樣品中脂類含量的分析通常采用索氏提取法或其他的抽提方法進(jìn)行，這些方法具有較高的準(zhǔn)確性，但涉及到干燥恒重，操作步驟復(fù)雜、測(cè)定周期長，因此尋找快速簡單的測(cè)定方法具有重要意義[1-2]。紫外吸收光譜是一種分子吸收光譜，在物質(zhì)的定性定量分析方面有著廣泛的應(yīng)用[3-8]。根據(jù)朗伯比爾定律，物質(zhì)吸收某一特征波長的紫外光，引起分子中價(jià)電子躍遷，而吸光度與該物質(zhì)的濃度成正比。根據(jù)文獻(xiàn)資料[9-10]，酮羰基或酯羰基的n-π*電子躍遷在210 nm附近有較強(qiáng)的吸收，而食用油脂的主要成分為甘油脂肪酸酯等脂類，這些脂類物質(zhì)在紫外區(qū)有較強(qiáng)的吸收，因此采用紫外吸收光譜法進(jìn)行定量分析具有可行性[11-13]。GB/T 22500—2008《動(dòng)植物油脂 紫外吸光度的測(cè)定》中對(duì)植物油的紫外吸收光譜進(jìn)行了分析，該標(biāo)準(zhǔn)采用動(dòng)植物油脂特性指標(biāo)“紫外吸光度”(百分吸光系數(shù))的測(cè)定方法，可用于判斷油脂加工精煉程度。但是該標(biāo)準(zhǔn)沒有涉及到紫外吸光度法在定量方面的應(yīng)用。本文以油茶籽油為研究對(duì)象，利用油茶籽油中甘油酯羰基的特征吸收與質(zhì)量濃度的定量關(guān)系，探討了1 μg/mL～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)油茶籽油的紫外吸收規(guī)律。該方法可以通過稀釋比色法快速測(cè)定油茶籽油提取過程中混合油的質(zhì)量濃度；同時(shí)還可以監(jiān)控溶劑回收過程中是否發(fā)生液泛現(xiàn)象，從而導(dǎo)致回收的溶劑中殘油率過高問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

精煉油茶籽油(金龍魚，規(guī)格為5 L)，購于超市；正己烷(色譜純)，購于探索平臺(tái)。

UV2800型紫外可見分光光度計(jì)，ATX124型精密電子分析天平。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同質(zhì)量濃度油茶籽油溶液的配制

準(zhǔn)確稱量1.000 g油茶籽油，用正己烷定容于100 mL容量瓶中，得到初始質(zhì)量濃度為10 mg/mL的油茶籽油溶液。以10 mg/mL的油茶籽油溶液為母液，分別用正己烷稀釋配制質(zhì)量濃度為1 μg/mL～10 mg/mL的油茶籽油溶液。

1.2.2 油茶籽油溶液紫外吸收光譜的測(cè)定

測(cè)量前0.5 h將紫外可見光光譜器打開，預(yù)熱使其穩(wěn)定。在兩個(gè)10 mm×10 mm石英比色皿中加入正己烷做空白校準(zhǔn)，校準(zhǔn)完后，向樣品比色皿加入試樣，在190～300 nm范圍內(nèi)掃描油茶籽油溶液，得到不同質(zhì)量濃度油茶籽油溶液紫外吸收光譜圖。繪制油茶籽油質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系曲線。

1.2.3 混合油中油茶籽油質(zhì)量濃度的紫外吸收光譜法驗(yàn)證

稱取2.50 g油茶籽油，用6號(hào)溶劑油定容至10.0 mL，得到質(zhì)量濃度為0.25 g/mL的混合油。取混合油1 mL于100 mL容量瓶中，加正己烷定容，然后按1.2.2的步驟，在240 nm測(cè)定樣品的吸光度。將測(cè)定的混合油質(zhì)量濃度與傳統(tǒng)測(cè)定方法[14]對(duì)比，考察其可靠性。

2 結(jié)果與討論

2.1 油茶籽油質(zhì)量濃度與吸光度之間關(guān)系的分段探討

本研究主要探討了1 μg/mL～10 mg/mL的油茶籽油溶液的紫外吸收光譜。由于在不同的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，吸光度與質(zhì)量濃度的關(guān)系有所差異，分1～10 μg/mL、10～100 μg/mL、0.1～1 mg/mL、1～10 mg/mL 4個(gè)區(qū)間探討油茶籽油質(zhì)量濃度與吸光度的定量關(guān)系。

2.1.1 1～10 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)譜圖結(jié)果分析

通過稀釋定容法，配制質(zhì)量濃度為1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 μg/mL的油茶籽油溶液，然后進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 質(zhì)量濃度為1～10 μg/mL油茶籽油的紫外吸收光譜

從圖1可以看出，當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度在1～10 μg/mL時(shí)，最大吸收波長在195 nm附近，同時(shí)吸光度隨樣品質(zhì)量濃度的增加而增加。為了探討質(zhì)量濃度與吸光度的線性關(guān)系，分別選取了195、200、210 nm 3個(gè)波長下吸光度與樣品質(zhì)量濃度的數(shù)據(jù)，采用Excel軟件作圖并進(jìn)行一次線性回歸分析，結(jié)果見圖2。

圖2 油茶籽油質(zhì)量濃度為1～10 μg/mL時(shí)各波長下

從圖2可以看出，3個(gè)波長下吸光度與質(zhì)量濃度均有較好的線性關(guān)系。根據(jù)朗伯比爾定律，對(duì)不同波長下的質(zhì)量吸收系數(shù)K進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)有較大的差異。在195、200、210 nm波長處，質(zhì)量吸收系數(shù)分別為34、28、6.2 L/(g·cm)。隨著吸收波長的增加，質(zhì)量吸收系數(shù)逐漸變小，但是質(zhì)量濃度與吸光度的線性相關(guān)系數(shù)R2值越接近于1。然而當(dāng)吸收波長為210 nm時(shí)，吸光度小于0.1，其質(zhì)量吸收系數(shù)為6.2 L/(g·cm)，得到的數(shù)據(jù)缺乏可信性。綜上，選擇200 nm作為該質(zhì)量濃度區(qū)間樣品的測(cè)定波長。

2.1.2 10～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)譜圖結(jié)果分析

考察了質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL油茶籽油的紫外吸收光譜，結(jié)果見圖3。

圖3 質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL油茶籽油的紫外吸收光譜

由圖3可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，吸光度逐漸增加，同時(shí)波峰位置也逐漸向長波方向移動(dòng)。當(dāng)吸收波長在200 nm以上時(shí)，樣品質(zhì)量濃度與吸光度有正相關(guān)性，選定波長分別為195、200、205、210 nm和215 nm，探討吸光度與樣品質(zhì)量濃度的關(guān)系，結(jié)果見圖4。

圖4 油茶籽油質(zhì)量濃度為10～100 μg/mL時(shí)各波長下質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系

從圖4可以看出，在195 nm與200 nm處，盡管吸光度隨質(zhì)量濃度增加而增加，但是在10～100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)并不成線性關(guān)系。而在205、210 nm與215 nm處具有線性關(guān)系。在205 nm處質(zhì)量吸收系數(shù)為11.5 L/(g·cm)，210 nm處質(zhì)量吸收系數(shù)為4.5 L/(g·cm)，215 nm處質(zhì)量吸收系數(shù)為1.2 L/(g·cm)。210 nm處的線性相關(guān)系數(shù)R2值最大，因此在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可以選擇210 nm作為測(cè)定波長。

2.1.3 0.1～1 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)譜圖結(jié)果分析

對(duì)質(zhì)量濃度為0.1～1 mg/mL油茶籽油的紫外吸收光譜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖5。

圖5 質(zhì)量濃度為0.1～1 mg/mL油茶籽油的紫外吸收光譜

從圖5可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，紫外吸收光譜最大吸收波長進(jìn)一步向長波方向移動(dòng)。同時(shí)吸光度在210 nm以上時(shí)，吸光度隨質(zhì)量濃度的增大而增大。選取200、210、215 nm和220 nm探討樣品質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系，結(jié)果見圖6。

圖6 油茶籽油質(zhì)量濃度為0.1～1 mg/mL時(shí)各波長下質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系

由圖6可知，在215 nm與220 nm處，質(zhì)量濃度與吸光度之間具有較好的線性關(guān)系，215 nm處的線性相關(guān)系數(shù)優(yōu)于220 nm處的，同時(shí)215 nm處吸光度數(shù)值也在理想的范圍之內(nèi)。故在0.1～1 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，測(cè)定波長以215 nm為佳。

2.1.4 1～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)譜圖結(jié)果分析

對(duì)質(zhì)量濃度為1～10 mg/mL油茶籽油的紫外吸收光譜進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖7。

圖7 質(zhì)量濃度為1～10 mg/mL油茶籽油的紫外吸收光譜

從圖7可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，紫外吸收光譜最大吸收波長進(jìn)一步向長波方向移動(dòng)。同時(shí)波長在220 nm以上時(shí)，吸光度隨質(zhì)量濃度的增大而增大。選取210、220、230、240 nm和250 nm探討樣品質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系，結(jié)果見圖8。

圖8 油茶籽油質(zhì)量濃度為1～10 mg/mL時(shí)各波長下質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系

從圖8可以看出，在220、230、240 nm與250 nm處，質(zhì)量濃度與吸光度之間具有較好的線性關(guān)系，240 nm處的線性相關(guān)系數(shù)優(yōu)于220、230 nm及250 nm，同時(shí)240 nm處吸光度數(shù)值也在理想的范圍之內(nèi)。故在1～10 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，測(cè)定波長以240 nm為佳。

2.2 最大吸收峰對(duì)應(yīng)的波長及吸光度與油茶籽油質(zhì)量濃度之間的關(guān)系分析

通過對(duì)各質(zhì)量濃度下紫外吸收光譜圖的分析，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度大于10 μg/mL時(shí)，最大吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長與樣品質(zhì)量濃度之間有一定的關(guān)系。樣品質(zhì)量濃度越大，最大吸收峰越向長波方向移動(dòng)。為此，繪制了最大吸收峰對(duì)應(yīng)的波長λmax與油茶籽油質(zhì)量濃度之間的關(guān)系曲線，結(jié)果見圖9。

從圖9可以看出，低質(zhì)量濃度時(shí)波長增長比較快，高質(zhì)量濃度時(shí)波長增長比較慢，符合對(duì)數(shù)方程的特點(diǎn)。因此，對(duì)其進(jìn)行對(duì)數(shù)曲線的擬合，得到曲線方程y=3.261 7lnx+187.28，式中：x為樣品的質(zhì)量濃度，μg/mL；y為最大吸收波長λmax，nm。該關(guān)系式具有較好的擬合度(R2=0.993 9)。

圖9 油茶籽油質(zhì)量濃度與最大吸收波長的關(guān)系曲線

同時(shí)還繪制了不同油茶籽油質(zhì)量濃度下，最大吸收波長處吸光度與樣品質(zhì)量濃度之間的關(guān)系曲線，結(jié)果見圖10。

圖10 油茶籽油質(zhì)量濃度與最大吸收波長處吸光度的關(guān)系曲線

由圖10可以看出，油茶籽油質(zhì)量濃度與最大吸收波長處吸光度之間存在對(duì)數(shù)關(guān)系，其曲線方程為y=0.426 1lnx-0.643 8，式中：x為樣品的質(zhì)量濃度，μg/mL；y為最大吸收波長處的吸光度。該關(guān)系式也具有一定的擬合度(R2=0.990 7)。

2.3 紫外吸收光譜法測(cè)定油茶籽混合油質(zhì)量濃度的驗(yàn)證

在利用浸出法制取食用油的過程中，混合油中油的含量一般在15%～40%之間。將混合油稀釋100倍，其含量為0.15%～0.4%之間，因此其質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL的范圍內(nèi)。為了考察該方法測(cè)定混合油質(zhì)量濃度的準(zhǔn)確性，參考浸出法工業(yè)化生產(chǎn)中混合油質(zhì)量濃度，配制了質(zhì)量濃度為0.25 g/mL的油茶籽油6號(hào)溶劑油溶液，將其稀釋100倍，則其質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL的范圍內(nèi)，平行測(cè)定5次吸光度，套用公式y(tǒng)=0.108 1x+0.012 9，得出混合油的質(zhì)量濃度，同時(shí)參照文獻(xiàn)[14]采用傳統(tǒng)的蒸發(fā)恒重法進(jìn)行了5次測(cè)量，結(jié)果見表1。

表1 紫外吸收法與傳統(tǒng)方法測(cè)定的油茶籽油混合油質(zhì)量濃度

由表1可知，兩種方法測(cè)定的平均值接近，紫外吸收法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差稍大。利用Excel進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見表2。

表2 單因素方差分析

由表2可知，F(xiàn)

對(duì)于一個(gè)質(zhì)量濃度未知的樣品，可以利用圖9中油茶籽油質(zhì)量濃度與最大吸收波長λmax的關(guān)系曲線或圖10油茶籽油質(zhì)量濃度與最大吸收波長處吸光度的關(guān)系曲線判斷其大致的質(zhì)量濃度范圍，然后采用相應(yīng)質(zhì)量濃度區(qū)間對(duì)應(yīng)的最佳測(cè)定波長進(jìn)行測(cè)量，并套用相應(yīng)的公式進(jìn)行計(jì)算。具體操作如下：可以先取一定量樣品，稀釋100倍，然后進(jìn)行全波長掃描，測(cè)定其最大吸收波長或最大吸收波長處吸光度。然后根據(jù)最大吸收波長或最大吸收波長處吸光度，計(jì)算出其大致的質(zhì)量濃度，判斷出其質(zhì)量濃度區(qū)間。接著采用相應(yīng)質(zhì)量濃度區(qū)間對(duì)應(yīng)的最佳測(cè)定波長進(jìn)行測(cè)量，并套用相應(yīng)的公式進(jìn)行計(jì)算。如果稀釋后最大吸收波長處對(duì)應(yīng)的吸光度小于0.1，則樣品無需稀釋，直接進(jìn)行全波長掃描確定質(zhì)量濃度區(qū)間。假設(shè)不稀釋，最大吸收波長處所對(duì)應(yīng)的吸光度仍然小于0.07，則其質(zhì)量濃度低于1 μg/mL，超出本方法的測(cè)定范圍。

3 結(jié) 論

本研究表明油茶籽油質(zhì)量濃度與吸光度之間具有良好的線性關(guān)系。當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度在 1～10 μg/mL時(shí)，最佳測(cè)定波長為200 nm，其曲線方程為y=0.028x+0.037 3；當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度在10～100 μg/mL時(shí)，最佳測(cè)定波長為210 nm，其曲線方程為y=0.004 5x+0.021 6；當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度在0.1～1 mg/mL時(shí)，最佳測(cè)定波長為215 nm，其曲線方程為y=0.993 3x+0.023 3；當(dāng)油茶籽油質(zhì)量濃度在1～10 mg/mL時(shí)，最佳測(cè)定波長為240 nm，其曲線方程為y=0.108 1x+0.012 9。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)了最大吸收峰對(duì)應(yīng)的波長及對(duì)應(yīng)的吸光度均與樣品質(zhì)量濃度之間存在對(duì)數(shù)關(guān)系，因此利用最大吸收峰的波長或其對(duì)應(yīng)的吸光度進(jìn)行定量分析也是一條值得研究的途徑。對(duì)于該方法在其他食用油脂的適用性以及不同儀器和溶劑體系中的比較，還需進(jìn)一步的研究過程。